Meso－四（對－羥基苯基）卟啉和溶菌酶的相互作用機理

趙婷婷，畢淑云，王 瑜，王天嬌，龐 博

（1.長春師范大學化學學院，長春 130032；2.吉林出入境檢驗檢疫局檢疫檢驗技術中心，長春 130062）

Meso－四（對－羥基苯基）卟啉和溶菌酶的相互作用機理

趙婷婷1，畢淑云1，王 瑜1，王天嬌1，龐 博2

（1.長春師范大學化學學院，長春 130032；2.吉林出入境檢驗檢疫局檢疫檢驗技術中心，長春 130062）

在模擬生理條件下，利用熒光光譜和同步熒光光譜法研究Meso－四（對－羥基苯基）卟啉（THPP）與溶菌酶的相互作用.結果表明：THPP對溶菌酶的猝滅過程為靜態猝滅；291K時，THPP與溶菌酶的結合常數為5.97×104L／mol；疏水作用力為THPP與溶菌酶的主要作用力；金屬離子Fe2＋，Fe3＋，Cu2＋，Mg2＋，Ca2＋和Zn2＋的存在不影響THPP與溶菌酶的結合常數；THPP與溶菌酶的結合距離為3.35nm；THPP可使色氨酸殘基周圍的極性減弱，疏水性增強.

meso－四（對－羥基苯基）卟啉；溶菌酶；熒光猝滅

溶菌酶是一種普遍存在于生物體內的小分子堿性蛋白，可與較多的內源和外源性物質結合，從而發揮其消炎、殺菌和抗病毒的作用［3］.近年來，對小分子與蛋白質結合的研究已引起人們廣泛關注［4－6］.本文應用Adler法［7］，即吡咯和取代苯甲醛在丙酸介質中回流，縮合得到THPP，選擇溶菌酶作為模型蛋白，研究THPP與溶菌酶的相互作用及對溶菌酶構象的影響.

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

RF－5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）；恒溫水浴鍋（南京桑力電子設備廠）；pH－3S數字酸度劑（南京桑力電子設備廠）；TU－1901型紫外－可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）.溶菌酶（長春鼎國生物科技有限公司）儲備液濃度為1.0×10－4mol／L，于4℃冰箱保存；THPP由長春師范大學無機實驗室合成，由無水乙醇配置的儲備液濃度為1.0×10－3mol／L；其他試劑為國產分析純；實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 儀器工作條件

在熒光測定中，λex＝280nm，激發和發射通帶寬度均為3nm，掃描范圍為290～450nm.紫外測定220～450nm的吸光度值.在同步熒光光譜掃描中，設定Δλ＝60nm.

1.3 方 法

將125μL溶菌酶溶液和不同濃度的THPP溶液依次加入比色管中，用pH＝7.4的Tris－HCl緩沖溶液定容至2.5mL.

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅機理

圖1為291K時在pH＝7.4的Tris－HCl緩沖溶液中5.0×10－6mol／L溶菌酶與THPP作用后的熒光光譜.在280nm激發溶菌酶時，其發射峰位于337nm處.由圖1可見，隨著THPP濃度的增大，溶菌酶的熒光強度不斷降低并發生藍移（從337nm移至333nm），即發生了猝滅作用，使得溶菌酶中色氨酸殘基的疏水性增強［8］.

熒光猝滅一般分為動態猝滅過程和靜態猝滅過程：靜態猝滅是指猝滅劑分子與熒光物質基態分子相互作用，生成非熒光復合物，導致熒光物質熒光強度降低；動態猝滅是指猝滅劑分子與熒光物質激發態分子相互碰撞，生成瞬時復合物而使其熒光猝滅.猝滅過程遵循Stern－Volmer方程［9］：

其中：F和F0分別為THPP存在和不存在時溶菌酶的熒光強度；c（THPP）為THPP的濃度；KSV為Stern－Volmer猝滅常數；τ0為溶菌酶的熒光壽命（生物大分子的τ0＝10－8s［9］）；Kq為猝滅速率常數，動態猝滅的猝滅常數與溫度成正比.圖2為不同溫度下溶菌酶與THPP結合的Stern－Volmer曲線.將曲線上的值代入式（1）可得KSV和Kq值，結果列于表1.由表1可見，隨著溫度的升高，KSV逐漸減小，且Kq遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散猝滅常數（2×1010L／（mol·s））［10］，表明THPP對溶菌酶的熒光猝滅過程為靜態猝滅過程，THPP與溶菌酶形成復合物.

圖1 291K時溶菌酶與THPP作用后的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of lysozyme in the presence of THPP at 291K

圖2 不同溫度下THPP與溶菌酶結合的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer curves for THPP binding to lysozyme at various temperatures

表1 不同溫度下Stern－Volmer的猝滅常數和猝滅速率常數Table 1 Stern－Volmer quenching constants and the quenching rate constants at various temperatures

2.2 結合常數與結合位點數及THPP與溶菌酶的結合作用力

THPP與溶菌酶相互作用的結合常數與結合位點數的計算公式［11］為

范德華力、氫鍵、靜電引力和疏水作用力等是藥物小分子與生物大分子間的主要作用力［12］.由Vant Hoff方程：

圖3 不同溫度下lg（（F0－F）／F）與lg（c（THPPt）－nc（溶菌酶t）（F0－F）／F0）的關系曲線Fig.3 Plots of lg（（F0－F）／F）vs lg（c（THPPt）－nc（lysozymet）（F0－F）／F0）at various temperatures

可得不同溫度下的ΔH，ΔG和ΔS值，結果列于表3.若ΔH＜0，ΔS＜0，則主要作用力為范德華力或氫鍵；若ΔH＜0或ΔH≈0，ΔS＞0，則主要作用力為靜電引力；若ΔH＞0，ΔS＞0，則主要作用力為疏水作用力［13］.由表3可見，ΔG＜0，表明溶菌酶與THPP的結合為自發過程，由ΔH＞0和ΔS＞0表明，溶菌酶與THPP主要靠疏水作用結合.

表2 溶菌酶與THPP在不同溫度下的結合常數KA和結合位點數nTable 2 Binding constants KAand binding sites nof THPP binding with lysozyme at various temperatures

表3 不同溫度下THPP與溶菌酶相互作用的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters for THPP binding to lysozyme at various temperatures

2.3 共存金屬離子對THPP與溶菌酶作用結合常數的影響

測定291K時5.0×10－6mol／L的Fe2＋，Fe3＋，Cu2＋，Mg2＋，Ca2＋和Zn2＋對THPP與溶菌酶結合常數的影響，結果列于表4.由表4可見，金屬離子的存在不影響THPP與溶菌酶的結合.

表4 291K時金屬離子對THPP與溶菌酶相互作用的影響Table 4 Effects of metal ions on the binding of THPP to lysozyme at 291K

2.4 THPP對溶菌酶構象的影響

Δλ＝60nm時濃度為5.0×10－6mol／L溶菌酶的同步熒光光譜如圖4所示.由圖4可見，隨THPP濃度的增加，溶菌酶的熒光強度逐漸降低，在341nm處的發射峰發生了藍移（從341nm移至336nm），進一步表明THPP使溶菌酶中色氨酸殘基周圍的極性減弱，疏水性增強［14］，溶菌酶的構象發生改變.

2.5 結合距離

根據F?rster非輻射能量轉移理論［15］，當溶菌酶的發射光譜與THPP的吸收光譜發生有效重疊時，溶菌酶與THPP間會發生非輻射能量轉移，其能量轉移效率E、給體－受體間的距離r0和臨界能量轉移距離R0的表達式分別為：

其中：R0是E為50%時的臨界距離；K2為熒光給體與受體間偶極躍遷的空間取向因子，平均值為2／3；n＝1.33［16］為介質折射常數；φ＝0.13為不存在受體時給體的熒光量子產率；J為給體的熒光發射光譜和受體的吸收光譜間的重疊積分.溶菌酶的熒光光譜與THPP吸收光譜的重疊曲線如圖5所示，其中溶菌酶和THPP的濃度均為5.0×10－6mol／L.計算結果列于表5.臨界能量轉移距離R0的理論值為5～10nm，給體和受體間結合距離r0的理論值為7～10nm［17］.由表5可見，THPP與溶菌酶的R0和r0均在理論值范圍內，因此，THPP與溶菌酶在相互作用過程中發生了非輻射能量轉移.

圖4 Δλ＝60nm時溶菌酶與THPP相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of lysozyme in the presence of THPP atΔλ＝60nm

圖5 THPP的吸收光譜與溶菌酶熒光光譜的重疊曲線Fig.5 Overlaps of the absorption spectra of THPP with the fluorescence spectra of lysozyme

表5 F?rster非輻射能量轉移參數Table 5 Parameters of F?rster non－radiation energy transfer

綜上所述，本文研究了THPP與溶菌酶的相互作用.結果表明，二者結合時溶菌酶內源性熒光發生了有規律的動態猝滅；二者間的主要作用力為疏水作用力；Zn2＋，Mg2＋，Ca2＋，Fe3＋，Cu2＋和Fe2＋不影響THPP與溶菌酶的結合常數；相互作用時THPP使色氨酸殘基周圍的極性減弱，疏水性增強；THPP與溶菌酶間的結合距離為3.35nm；溶菌酶可攜帶THPP在體內進行運轉、貯存和分配.

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（責任編輯：單 凝）

Interaction Mechanism of Meso－tetra（4－hydroxyphenyl）porphyrin and Lysozyme

ZHAO Tingting1，BI Shuyun1，WANG Yu1，WANG Tianjiao1，PANG Bo2
（1.College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun130032，China；2.Technology Center of Inspection and Quarantine，Jilin Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun130062，China）

Meso－tetra（4－hydroxyphenyl）porphyrin（THPP）interacting with lysozyme was investigated by the fluorescence spectroscopy under simulated physiological conditions.The results indicate that THPP quenched the intrinsic fluorescence of lysozyme via a static quenching procedure.The binding constant KAbetween THPP and lysozyme was 5.97×104L／mol at 291K.According to the thermodynamic parameters，it was obtained that hydrophobic was a main acting force between THPP and lysozyme.The presence of Fe2＋，Fe3＋，Cu2＋，Mg2＋，Ca2＋and Zn2＋did not affect the binding constant of THPP and lysozyme.According to F?rster’s non－radiative energy transfer theory，the distance between THPP and lysozyme was 3.35nm.The synchronous fluorescence spectra reveal that the vicinity of tryptophan becomes more hydrophobicity with the increase of THPP.

meso－tetra（4－hydroxyphenyl）porphyrin（THPP）；lysozyme；fluorescence quenching

O657.3

A

1671－5489（2014）04－0820－05

卟啉是卟吩環上連有取代基的一類大環化合物總稱，在自然界和生命體中（如血紅素和葉綠素等）廣泛存在，在生命的新陳代謝過程中發揮重要作用［1］.Meso－四（對－羥基苯基）卟啉（THPP）是一種具有親水羥基的非水溶性卟啉，在生物學和醫學領域應用前景廣闊［2］.

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.37

2013－12－09.

趙婷婷（1990—），女，漢族，碩士研究生，從事光譜分析化學的研究，E－mail：949427203＠qq.com.通信作者：畢淑云（1970—），女，漢族，博士，教授，從事光譜分析化學的研究，E－mail：sy＿bi＠sina.com.

吉林省自然科學基金（批準號：20140101023JC）、吉林省教育廳“十二五”科技項目（批準號：20140257）和長春師范大學研究生創新基金（批準號：CSCXY2013008）.