異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑結構的修飾

劉志遠，張愛臣，劉新濤，關曉俠，李玲玲，殷玉和

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，長春 130012；2.吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033）

異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑結構的修飾

劉志遠1，張愛臣2，劉新濤1，關曉俠1，李玲玲1，殷玉和1

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，長春 130012；2.吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033）

利用Fmoc固相多肽合成法，按已知異檸檬酸裂解酶抑制劑的直鏈肽氨基酸序列合成首尾相連的環肽抑制劑.經色譜純化和質譜鑒定，其相對分子質量的實測值與理論值相符.抑制率實驗結果表明，合成的環肽對異檸檬酸裂解酶有明顯抑制作用，抑制率大于50%.采用高效液相色譜法分別檢測直鏈肽和環肽在血漿中的半衰期，實驗結果表明，環肽在血漿中的半衰期為11min，比直鏈肽的半衰期延長175%.

異檸檬酸裂解酶；肽類；抑制劑；環肽

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2－CTC樹脂、芴甲氧基羰基（Fmoc）－氨基酸（Fmoc－Pro－OH，Fmocsn（Trt）－OH，Fmoc－Ser（tBu）－OH，Fmocrg（Pbf）－OH）、Fmoc－Glu－Oallyl、苯并三氮唑－N，N，N′，N′－四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1－羥基苯并三氮唑（HOBT）、N，N－二異丙基乙胺（DIEA）、三異丙基硅烷（TIS）和三氟乙酸（TFA）均為吉爾生化（上海）公司產品；N－甲基嗎啉（NMM）、四（三苯基膦）鈀（Pb（pph3）4）、茚三酮、二氯甲烷（DCM）、N，N二甲基甲酰胺（DMF）、六氫哌啶（哌啶，PIP）、無水乙醚、無水甲醇和無水乙醇均為北京化工廠產品.

PET28b－ICL菌種由長春工業大學ICL抑制劑實驗組提供，于－80℃冰箱保存.血漿由長春市中心血站提供.

1.2 儀 器

循環水式真空泵（河南予華儀器有限公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；制備型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；恒溫培養搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；凍干機（上海東富龍科技有限公司）；超微量分光光度計（美國Thermo Scitific公司，Namo Drop2000型）；電泳儀（上海捷邁科貿有限公司）；分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；質譜儀（德國Bruker公司）.

1.3 方 法

1.3.1 環肽的固相合成 根據直鏈肽肽序列中含有谷氨酸的特點，以及肽鏈首尾環化的要求，設計如圖1所示的固相合成環肽方法.

圖1 固相合成環肽流程Fig.1 Solid phase synthesis of cyclic peptide

1.3.2 環肽的分析、純化與分子量鑒定 用高效液相色譜分析環肽粗品，高效液相色譜分析條件：C18色譜柱（4.6nm×250nm）；流動相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有機相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05；進樣量為10μL，流速為1mL／min.

用制備型高效液相色譜儀純化環肽純品，制備條件：C18色譜柱（20nm×250nm）；流動相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.25；有機相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝60∶40∶0.25；流速為10mL／min.將所得肽純品真空冷凍干燥后于－20℃冰箱保存備用.

利用質譜儀測量高效液相色譜儀主峰產物的相對分子質量，檢測模式為反射模式.

1.3.3 ICL的提取 對菌種PET28b－ICL進行增菌培養，當OD值為0.6～0.8時，加入異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）對ICL進行誘導表達.在誘導表達后的菌體中加入菌體裂解液（50mmol Tris－HCl，pH＝8.0），吹勻菌體，于冰上攪拌30min后冰浴下超聲破菌至透明，靜置30min以上，以10 000r／min離心30min后，取上清液，用鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析柱進行純化.純化后的ICL蛋白經十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進行鑒定分析.

1.3.4 合成環肽對ICL抑制作用的檢測 異檸檬酸在ICL的催化下生成琥珀酸和乙醛酸.乙醛酸可通過乳酸脫氫酶（LDH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）還原為甘醇酸酯，其中NADH在340nm處的光吸收值最大.通過分析實時監測NADH在340nm處光吸收值的變化可檢測ICL的酶活性.

在總體積為600μL反應體系中加入一定量的3－（N－嗎啉基）丙磺酸（MOPS）緩沖液（50mmol／L MOPS，5mmol／L MgCl2，5mmol／L L－cysteine，1mmol／L EDTA，pH＝6.8）、純化蛋白ICL 50mL、LDH 10μL和NADH 40μL（2mmol），在37℃恒溫水浴中作用20min，加入100μL異檸檬酸（20mmol／L），用超微量分光光度計實時監測340nm處的光吸收值.同時設不加酶和不加底物（異檸檬酸）的對照組.

向上述反應體系中加入50μL合成的環肽，用超微量分光光度計實時監測340nm處的光吸收值.抑制率計算公式為

1.3.5 合成環肽在血漿中的穩定性檢測 將180μL乙腈沉淀后的血漿于37℃孵育5min.取20μL濃度為10－2mol／L合成的環肽置于正在孵育的血漿中，震蕩均勻后迅速取出20μL混合液置于離心管中，將其記為0min樣品，然后分別在5，10，15，20，25，30min各取出20μL樣品.

酶解過程的終止：在取出的樣品中加入90μL乙腈振蕩混勻后，將樣品置于冰上5min，再用90μL（體積分數為0.5%）的冰醋酸稀釋終止酶解過程.以13 000r／min離心15min，取上清液，于－80℃冰存，以備高效液相色譜儀分析［14］.

高效液相色譜條件：C18色譜柱（4.6nm×250nm）；流動相A為V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有機相B為V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05，洗脫梯度為5%～95%，進樣量為10μL，流速為1mL／min.

由峰面積計算可得肽的質量濃度ρ，將肽質量濃度的對數（lgρ）和時間（t）進行線性回歸，由回歸方程可得半衰期［5］為

2 結果與討論

2.1 環肽粗品的分析與純化

肽與樹脂分離后，在真空中干燥可得白色環肽粗品176mg，經制備型高效液相色譜法（HPLC）純化，收集目標產物峰真空冷凍干燥可得質量分數為99.3%的肽純品25mg.肽純品HPLC的檢測結果如圖2所示，分子結構如圖3所示.純化后環肽的分子量為777.83，與目標環肽相對分子質量一致.

圖2 純化后環肽HPLC的檢測結果Fig.2 HPLC graph of the high purity cyclic peptide

圖3 目標環肽分子結構Fig.3 Molecular structure of the target cyclic peptide

2.2 ICL濃度檢測

將經鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析純化后的酶蛋白分裝在7支EP管中，對7支EP管中的酶蛋白進行SDS－PAGE檢測，結果如圖4所示.由圖4可見，5號EP管中蛋白的質量分數最高，將其于－80℃冰存，以備酶活性檢測.

2.3 ICL的酶活性實驗

分別將直鏈肽與合成的環肽（5mg／mL）置于檢測酶活性的反應體系中，總反應時間為600s，實時監測NADH在340nm處的吸光度值.直鏈肽與環肽對ICL抑制作用的檢測結果如圖5所示.由圖5可見：在直鏈肽與ICL的反應體系中，反應時間為330s；在環肽與ICL的反應體系中，反應時間為410s；抑制率分別為55.5%和64.7%.

圖4 ICL的SDS－PAGE檢測結果Fig.4 SDS－PAGE graph of ICL

圖5 環肽和直鏈肽對ICL抑制作用的檢測結果Fig.5 Inhibition effects of the cyclic peptide and the linear peptide on ICL

2.4 環肽在血漿中的穩定性實驗

在血漿中分別加入質量濃度均為2mg／mL的直鏈肽和環肽，直鏈肽和環肽在血漿中的半衰期如圖6所示.由圖6可見，直鏈肽和環肽的半衰期分別為4min和11min，即環化后的肽比直鏈肽的半衰期延長175%.

圖6 直鏈肽（A）和環肽（B）在血漿中的半衰期Fig.6 Half－life of the linear peptide（A）and the cyclic peptide（B）

綜上可見，本文采用Fmoc固相合成法合成了首尾相連環肽［cyclo（Asn－Pro－Pro－Glurg－Ser－Pro）］，其分子量為777.83，質量分數為99.3%，對ICL的抑制率為64.7%，半衰期為11min.

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（責任編輯：單 凝）

Modification of Isocitrate Lyase Peptide Inhibitor

LIU Zhiyuan1，ZHANG Aichen2，LIU Xintao1，GUAN Xiaoxia1，LI Lingling1，YIN Yuhe1
（1.School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changhun130012，China；2.China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changhun130033，China）

Fmoc solid－phase peptide synthesis was used to synthesize cyclic peptide in light of the known isocitrate lyase linear peptide sequence according to the end to end way.Mass spectrometry demonstrates that the measured value of relative molecular mass is consistent with the theoretical value.Inhibition test confirms that the cyclic peptide shows significant inhibition to the ICL activity（the inhibition rate was more than 50%）.At the same time，half－life of linear peptide and that of cyclic peptide in plasma were measured by HPLC.Results indicate that half－life of cyclic peptide in plasma amounts to 11min，which is increased by 175%compared with that of linear peptide.

isocitrate lyase；peptide；inhibitor；cyclic peptide

Q78

A

1671－5489（2014）04－0847－05

結核病（tuberculosis）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium）引起的慢性傳染病.結核桿菌被巨噬細胞吞噬后，在巨噬細胞內轉為持留狀態，通過乙醛酸循環途徑獲取能量，維持其在宿主體內的長期持留存在［1］.異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循環中的關鍵限速酶之一，對結核桿菌維持其持留狀態起決定性作用［2］.氨基酸序列為NPPERSP的直鏈肽對異檸檬酸裂解酶有明顯抑制作用［3］.吳從梅等［4］利用噬菌體肽庫篩選技術與Fmoc固相合成法合成了對ICL具有抑制作用的直鏈肽；遲強等［5］將胸腺五肽合成胸腺五肽乙酯，使其在血漿中的半衰期由1.3min延長至2min.由于直鏈肽藥物進入體內后可被酶迅速代謝降解，因此其半衰期較短.通過化學修飾可延長多肽類藥物的半衰期［6］.

研究表明，將直鏈肽合成為環肽可提高多肽的活性和穩定性［7］.在環肽合成中，固相合成法與液相合成法相比，能有效避免發生二聚和多聚等副反應［8－10］.本文將直鏈肽NPPERSP進行首尾相連環化，獲得了生物活性較高的環肽抑制劑［11－13］，并對合成的環肽分別進行異檸檬酸裂解酶抑制率檢測和血漿中穩定性的檢測.

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.42

2013－09－29.

劉志遠（1987—），男，漢族，碩士研究生，從事生物制藥的研究，E－mail：124273183＠qq.com.通信作者：殷玉和（1972—），男，漢族，博士，講師，從事生物制藥的研究，E－mail：yyh72＠sina.com.

吉林省教育廳科技發展計劃項目（批準號：2009110）.