DhHP－6及Exenatide對胰島β細胞的協同作用

雷莉妍，王 迪，張廣吉，郭佑銘，王麗萍，2

（1.吉林大學生命科學學院，長春 130012；2.吉林大學中日聯誼醫院急救醫學科，長春 130033）

DhHP－6及Exenatide對胰島β細胞的協同作用

雷莉妍1，王 迪1，張廣吉1，郭佑銘1，王麗萍1，2

（1.吉林大學生命科學學院，長春 130012；2.吉林大學中日聯誼醫院急救醫學科，長春 130033）

采用葡萄糖和棕櫚酸鈉（Glu－Pal）聯合誘導大鼠胰島瘤RINm－5F細胞凋亡，用噻唑藍比色（MTT）實驗檢測次血紅素六肽（DhHP－6）和Exenatide分別或聯合作用對細胞凋亡的影響.結果表明：DhHP－6和Exenatide均顯著抑制Glu－Pal誘導β細胞凋亡，但二者無協同作用；DhHP－6和Exenatide均明顯促進RINm－5F細胞增殖，且有顯著的協同作用.

次血紅素六肽；Exenatide；胰島β細胞；協同作用

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

大鼠胰島瘤細胞RINm－5F（美國ATCC公司）；DhHP－6和Exenatide由吉林大學生命科學學院生物大分子實驗組合成；葡萄糖（北京化工廠）；棕櫚酸鈉（美國Sigma公司）；PCR試劑及總RNA抽提試劑盒（美國Invitrogen公司）；RPMI 1640和OPTI－MEM培養基（美國Life Techologies公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）.

1.2 實 驗

1.2.1 細胞培養 將RINm－5F細胞置于RPMI 1640培養基（含體積分數為10%的胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺和1.0mmol／L丙酮酸鈉）中，在37℃，體積分數為5%的CO2培養箱內培養.

1.2.2 Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡模型的建立 將密度為每孔2×104個的RINm－5F細胞接種于96孔板中過夜培養，使細胞充分貼壁.棄去細胞上層培養基，加入含不同濃度配比的葡萄糖與棕櫚酸鈉的新鮮培養基，培養48h，利用噻唑藍比色（MTT）實驗檢測細胞凋亡率，建立細胞凋亡模型.

1.2.3 DhHP－3與Exenatide單獨及聯合作用對Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡的影響 將密度為每孔2×104個的RINm－5F細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后，棄去舊培養基，分別加入含不同濃度的DhHP－6和Exenatide或不同濃度配比的DhHP－6和Exenatide的新鮮培養基，培養1h，加入Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡，繼續培養48h.用MTT實驗檢測細胞凋亡率.

1.2.4 PCR檢測凋亡相關基因mRNA水平 將密度為每孔106個的RINm－5F細胞接種于6孔板中，當細胞生長至80%融合時，分為空白組、凋亡模型組、DhHP－6保護組和Exenatide保護組，培養48h后提取mRNA.經反轉錄PCR（RT－PCR）和實時定量PCR（real time－PCR）檢測相關基因表達情況.以βctin作為內參［12］，各基因的特異性引物序列列于表1.

表1 凋亡相關基因的特異性引物序列Table 1 Primers for genes related to apoptosis

1.2.5 DhHP－3與Exendin－4單獨及聯合作用對RINm－5F細胞增殖的影響 將密度為每孔2×104個的RINm－5F細胞接種于96孔板中過夜培養.棄去舊培養基，分別加入含不同濃度的DhHP－6和Exenatide或不同濃度比的DhHP－6和Exenatide培養基培養24h.用MTT實驗檢測細胞相對增殖率.

1.3 統計學處理

用統計學軟件SPSS 10.0進行統計學分析.數據經方差齊性檢驗，符合正態分布.結果以±SD表示，組間比較采用t檢驗，若p＜0.05，則數據視為具有統計學差異.

2 結果與討論

2.1 Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡模型的建立

研究表明，長期高糖高脂能誘導胰島β細胞凋亡［13］.本文用Glu和Pal聯合誘導RINm－5F細胞凋亡，檢測了不同濃度比例的Glu和Pal作用48h對RINm－5F細胞存活率的影響，結果如圖1所示.由圖1可見：高濃度的Pal對細胞存活率影響較大，且作用不穩定；當12.5mmol／L Glu和0.1mmol／L Pal作為凋亡誘導條件時，細胞凋亡率較合適（41.8%），且作用較穩定.

2.2 DhHP－6及Exenatide對Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡的影響

當c（Glu）＝12.5mmol／L，c（Pal）＝0.1mmol／L時，DhHP－6及Exanatide對Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡的影響如圖2所示.由圖2可見，二者的保護作用均具有濃度依賴性.其中DhHP－6對細胞凋亡的抑制作用較強，當DhHP－6的濃度為24μmol／L時，基本能完全抑制Glu－Pal誘導的細胞凋亡.

2.3 DhHP－6及Exenatide對RINm－5F細胞中凋亡相關基因mRNA表達量的影響

高糖和高脂可引起bcl－2基因家族一些成員表達發生變化而誘導β細胞凋亡［14］.DhHP－6和Exenatide對RINm－5F細胞中凋亡相關基因mRNA的影響如圖3所示.由圖3可見：與空白對照組相比，模型組抗凋亡基因bcl－2和sirt1mRNA表達量下降（分別為對照組的0.21和0.29倍），凋亡基因bax的mRAN表達量提高（約為對照組的1.43倍）；加入DhHP－6后，sirt1和bcl－2的mRNA表達量提高（分別為對照組的0.52和0.97倍），bax的mRNA表達量顯著下降（約為對照組的0.7倍）；加入Exenatide后，sirt1和bcl－2的mRNA表達量提高（分別為各自對照組的0.33和0.42倍），bax與模型組的mRNA表達量相比變化較小.DhHP－6和Exenatide對凋亡相關基因sirt1和bcl－2具有類似的作用，但對bax的影響完全不同，表明二者可能通過不同的信號途徑發揮抗凋亡作用.

圖1 Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡Fig.1 Apoptosis of RINm－5Fcells induced by Glu－Pal

圖2 DhHP－6（A）及Exenatide（B）對Glu－Pal誘導的RINm－5F細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of DhHP－6（A）and Exenatide（B）on the apoptosis of RINm－5Fcells induced by Glu and Pal

圖3 DhHP－6和Exenatide對RINm－5F細胞中凋亡相關基因mRNA表達量的影響Fig.3 Effects of DhHP－6and Exenatide on mRNA level of genes related to apoptosis in RINm－5Fcells

2.4 DhHP－6及Exenatide對RINm－5F細胞增殖的影響

利用不同濃度的DhHP－6或Exenatide處理RINm－5F細胞24h，通過MTT實驗檢測細胞的增殖情況，結果如圖4所示.由圖4可見，DhHP－6及Exenatide均顯著刺激RINm－5F細胞增殖，且二者的作用均具有濃度依賴性，其中DhHP－6的增殖活性更強.

圖4 DhHP－6（A）和Exenatide（B）對RINm－5F細胞增殖的影響Fig.4 Effects of DhHP－6（A）and Exenatide（B）on the proliferation of RINm－5Fcells

2.5 DhHP－6和Exenatide聯合作用對RINm－5F細胞凋亡的影響

選擇c（DhHP－6）∶c（Exenatide）＝1∶2.5，并進行梯度稀釋研究二者在抗RINm－5F細胞凋亡過程中的協同作用.用A表示DhHP－6對β細胞凋亡的抑制率，用B表示Exenatide對細胞凋亡的抑制率，AB表示二者聯合作用對細胞凋亡的抑制率.若AB＞A＋B，則可判斷AB作用具有協同性.當c（Glu）＝12.5mmol／L，c（Pal）＝0.1mmol／L時，不同濃度的DhHP－6與Exenatide聯合作用對RINm－5F細胞凋亡的影響如圖5所示.由圖5可見，DhHP－6和Exenatide聯合作用均大于DhHP－6和Exenatide單獨作用對RINm－5F細胞凋亡的抑制率，但小于DhHP－6和Exenatide單獨作用對細胞凋亡的抑制率之和，因此二者的抗RINm－5F細胞凋亡作用沒有協同性.

2.6 DhHP－6和Exenatide聯合作用對RINm－5F細胞增殖的影響

選用c（DhHP－6）∶c（Exenatide）＝4，并進行梯度稀釋，處理RINm－5F細胞24h，通過MTT實驗檢測細胞的相對增殖率，結果如圖6所示.由圖6可見，DhHP－6和Exenatide聯合作用效果大于DhHP－6和Exenatide單獨作用效果之和，因此二者對促進RINm－5F細胞增殖具有協同作用.

圖5 DhHP－6和Exenatide聯合作用對RINm－5F細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of DhHP－3combined with Exenatide on the apoptosis of RINm－5Fcells

圖6 DhHP－6和Exenatide聯合作用對RINm－5F細胞增殖的影響Fig.6 Effect of DhHP－6combined with Exenatide on the proliferation of RINm－5Fcells

綜上所述，DhHP－6和Exenatide均顯著抑制Glu－Pal誘導RINm－5F細胞凋亡，在促進RINm－5F細胞增殖時具有顯著的協同作用.

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（責任編輯：單 凝）

Synergistic Effects of DhHP－6and Exenatide on PancreaticβCells

LEI Liyan1，WANG Di1，ZHANG Guangji1，GUO Youming1，WANG Liping1，2
（1.College of Life Science，Jilin University，Changchun130012，China；2.Department of Emergency，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

Apoptosis of pancreaticβcell RINm－5Fwas induced by glucose coupled with sodium palmitate.Effects of DhHP－6or／and Exenatide on the apoptosis of RINm－5Fcell were detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.DhHP－6and Exenatide decreased the apoptosis induced by Glu－Pal significantly without no synergistic effect between them.In addition，we also found that DhHP－6and Exenatide both stimulated the proliferation of RINm－5Fcells，and there was a synergistic effect between them.

DhHP－6；Exenatide；pancreaticβcell；synergistic effect

Q28

A

1671－5489（2014）04－0835－05

2型糖尿病是一種慢性代謝綜合癥［1］，高糖是其顯著的臨床特征.由于高糖和高脂具有的細胞毒性會導致胰島β細胞凋亡［2］，因此2型糖尿病患者的胰島β細胞數量均減少.

Exenatide是治療2型糖尿病的藥物，是一種胰高血糖素樣肽1（GLP－1）類似物，但比GLP－1擁有更好的血漿穩定性.Exenatide與胰島β細胞上的GLP－1受體有高度的親和性，在治療2型糖尿病過程中，Exenatide可促進胰島素分泌，并具有促進胰島β細胞增殖、分化和抗β細胞凋亡的作用［3－5］.次血紅素六肽（DhHP－6）是由吉林大學生命科學學院生物大分子實驗組設計并合成的過氧化物酶模擬物［6－8］.目前，多基因、多組織疾病，如腫瘤和糖尿病，單個靶點的藥物在治療時很難達到預期療效［9］.而針對多靶點的藥物聯合治療能同時調節疾病網絡中的多個環節，并且藥物間常表現出協同作用，具有突出的效果，在重大疾病治療中的應用越來越廣泛［10－11］.本文探討DhHP－6與Exenatide在胰島β細胞凋亡和增殖過程中的協同作用.

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.40

2013－09－29.

雷莉妍（1985—），女，漢族，博士研究生，從事藥物篩選的研究，E－mail：liyanlei－2005＠163.com.通信作者：王麗萍（1967—），女，漢族，博士，教授，博士生導師，從事藥物篩選的研究，E－mail：wanglp＠jlu.edu.cn.

吉林省自然科學基金（批準號：201015171）、吉林省科技發展計劃項目（批準號：201205017）、吉林省醫藥產業發展專項基金（批準號：YYZX201150－2）和長春市科技局社會發展科技支撐計劃項目（批準號：12SF23）.