中藥軟肝寧對實驗性肝纖維化大鼠TGFβ1Smad2/3表達的影響

王桂杰+李巖

【摘要】目的觀察四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化后應用軟肝寧的療效及作用機制。方法用40% CCl4對Wistar大鼠造模8周, 將50只分為中藥預防組、中藥治療組、模型對照組及正常對照組, 用軟肝寧于造模第1周及第4周開始灌胃。運用免疫組織化學(S-P)技術檢測轉化生長因子β1 (TGFβ1)、Smad2/3在肝內表達, 堿水解法檢測肝組織羥脯胺酸(Hyp)含量, 酶聯免疫法檢測肝組織內透明質酸(HA)的含量。結果經軟肝寧防治后大鼠肝組織內TGFβ1、Smad2/3表達減少, 透明質酸、羥脯胺酸水平降低。結論復方中藥制劑軟肝寧能有效地逆轉四氯化碳誘導肝纖維化大鼠的纖維化, 其機理可能是抑制肝內TGFβ1、Smad2/3 表達。

【關鍵詞】中藥；肝纖維化； 羥脯胺酸；透明質酸；轉化生長因子β1；Samd2/3

Effect of traditional Chinese medicine Ruan Gan Ning on the expression of TGFβ1 and Smad2/3 in the experimental rat hepatic fibrosis WANG Gui-jie. LI Yan. Shengyang Sixth People's Hopspital, Shenyang 110006, China

【Abstract】Objective?To observe the therapeutic effect and mechanism of Ruan Gan Ning on the rat hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4). Methods?50 Wistar rats were divided into normal control , model control, TCM prevention and TCM therapy groups. At the first and forth week of model-making, the rats were given Ruan Gan Ning through intragastric administration. The expression of TGFβ1 and Smad2/3 in the liver tissue was detected with immunohistochemistry(S-P) and the content of Hyp with alkaline hydrolysis, the content of hyaluronic acid(HA) with euzymelinked immunosorbent assay. Results?After the application of Ruan Gan Ning the expression of TGFβ1, Smad2/3 and the level of HA and Hyp decreased in the experimental rat hepatic fibrosis. Conclusion?Ruan Gan Ning can relieve the rat hepatic fibrosis induced by CCL4 and the mechanism of action may be its inhibition of expression of TGFβ1, Smad2/3 in the liver tissue.

【Key words】Traditional Chinese medicine; Hepatic fibrosis; Hyaluronic acid; Transforming growth factor β1; Smad2/3本文針對肝纖維化“瘀血”、“癥積痞塊”所致病理癥結, 擬以疏肝理脾、活血化瘀治療原則的軟肝寧方劑, 進行實驗研究, 以期闡明該方治療肝纖維化的作用機制。

1材料與方法

1. 1材料

1. 1. 1實驗動物由中國醫科大學第二臨床學院實驗動物中心提供的雌雄各半、清潔級 Wistar大鼠50只。

1. 1. 2實驗藥物軟肝寧內含柴胡20 g、白術12 g、桃仁12 g等, 購于遼寧中醫學院藥劑科, 煎好用干燥箱加工成顆粒劑備用, 用前溶解成濃度0.4 g/ml的溶液。

1. 2儀器與試劑

1. 2. 1模型制備肝纖維化大鼠模型制作參照Mont fort等方法略加改進。Wistar 大鼠, 雌雄各半, 體質量160~260 g, 按2 ml/kg體質量, 2次/周腹腔注射40 % CCl4造模8周。

1. 2. 2主要試劑羥脯胺酸(Hyp)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；透明質酸(HA)試劑盒購于上海森雄科技實業有限公司；免疫組織化學TGFβ1、Smad2/3一抗及二抗試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1. 2. 3主要儀器全自動圖像分析系統為C5050及圖像分析軟件。

1. 3方法

1. 3. 1分組及用藥大鼠50只, 隨機分為四組：A組為正常組(即空白對照組)(n=8), B組為肝纖維化模型組(n=12), C組為中藥預防組(n=12), D組為中藥治療組(n=18)。B、C、D 組造膜, C、D 組分別于造模第1、4周開始中藥軟肝寧灌胃, C組、D組3 ml/kg灌胃。全部大鼠于第8 周末處死, 處死前稱體質量, 剖腹取肝右葉于10%中性甲醛固定, 余肝組織-70℃冰箱保存。

1. 3. 2實驗方法HA均需要肝勻漿制備：肝組織解凍后, 生理鹽水反復沖洗, 濾紙吸干, 切取小塊, 電子分析天平精確稱重(150±5)mg, 置于干凈試管內, 按11:9加入生理鹽水, 高速分散器勻漿, 低溫高速離心機3000 r/min , 15 min后, 取上清液, 以上操作均于冰浴中進行, 應用酶聯免疫法按試劑盒說明進行檢測。Hyp檢測為堿水解法, 按試劑盒說明進行。免疫組化采用S -P法檢測, 按照試劑盒說明書操作。

1. 3. 3免疫組化結果量化隨機選取每張切片6個視野(×400倍), 采用全自動圖像分析進行定量分析, 測定陽性細胞的吸光度(A值)及面積, 以兩者乘積表示組織中該抗原相對含量, 乘積越大表示抗原含量越高。

1. 4統計學方法采用SPSS13.0統計軟件對數據進行分析, 計量資料數據以均數±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗, P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2. 1動物一般狀況觀察模型組大鼠從實驗開始后1 周起每次腹腔注射后興奮, 躁動不安。隨著造模時間延長, 飲食下降, 喜臥, 毛色漸無光澤, 大便稀軟不成形, 體質量明顯比正常組低, 精神萎靡不振。應用軟肝寧灌胃后飲食好轉、體質量增加。實驗過程中B組大鼠死亡4只, C組實驗中死亡3只, D組實驗中死亡5只, 實驗結束時各組大鼠數量: 正常組8只, 模型組8 只, 中藥預防組9只, 中藥治療組13只。實驗終末A組平均每只體質量增加(107.00±12.20)g；B組每只體質量增加(45.75±10.01)g；顯著低于A 組(P<0.01)；C組平均每只體質量增加(65.2±9.3)g, D組平均每只體質量增加(63.85±10.86)g, C、D組與A組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

endprint

2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝組織中的表達與分布?陽性組織呈棕色, 陰性部分呈藍色。①A組肝組織: Smad2/3在正常肝細胞內, 匯管區基質及間質細胞胞漿內均無表達, TGFβ1在上述部位無表達, 在Disse 間隙偶有表達。②B組肝組織: 肝內TGFβ1、Smad2/3表達明顯強, TGFβ1表達極為強烈, 陽性細胞數目明顯增多, 主要見于小葉周圍擴大的纖維組織內的成纖維細胞、竇周細胞、炎性細胞以及增生的膽小管周圍梭狀細胞及肝細胞內, 陽性物質主要集中在胞漿內, 胞膜上也有少量表達。本組肝組織Smad2/3 表達主要集中在肝細胞胞漿內, 陽性細胞著色棕黃。③ C、D 組：TGFβ1、Smad2/3在肝組織內的表達量較B組減少, 陽性表達集中同B組, 陽性程度弱于B 組, D組表達明顯強于C組。各種成分在不同實驗組中表達經計算機軟件分析結果, 見表1, 圖1。

表1中藥對大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表達量化結果的影響( x-±s)

組別 例數 TGFβ1 Smad2/3

正常組 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型組 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

預防組 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治療組 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01；與治療組比較cP<0.05；與治療組比較dP>0.05

圖1?中藥對各組大鼠肝組織中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化結果的影響

2. 3中藥軟肝寧對CCl4肝纖維化大鼠肝組織的Hyp、HA影響試驗結束時模型組肝組織Hyp、HA數值遠遠高于正常組, 而中藥治療組和中藥預防組Hyp、HA數值低于模型組。各組與正常組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組、治療組與模型組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組觀察指標雖明顯優于治療組, 但兩者比較差異無統計學意義。具體結果見表2。

表2各組大鼠肝組織Hyp及HA比較( x-±s)

組別 例數 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常組 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型組 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治療組 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

預防組 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：與正常組比較bP<0.01, 與模型組比較aP<0.01, 與治療組比較cP>0.05

3討論

軟肝寧方劑中柴胡為君藥疏肝, 臣藥炒白術補脾, 再配以丹參、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中醫辨證治療纖維化原則。方中丹參能夠顯著抑制成纖維細胞的增生, 使星狀細胞凋亡［1］。川芎嗪能減少透明質酸和膠原產生, 并提高肝組織SOD的活性, 減少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 從而抑制肝星狀細胞活化, 減緩肝纖維增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纖維化機制是能增加肝血流量, 降低肝組織膠原含量, 促進肝內纖維膠原分解代謝［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纖維化的最重要細胞因子之一［4］。在肝臟中肝星狀細胞、肝細胞、枯否氏細胞、血小板等多種細胞產生此種因子, 可促進HSC活化并分泌多種膠原, 激活靜止狀態的HSC, 抑制細胞外基質( ECM)降解、進而抑制肝細胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信號在細胞內轉導的蛋白, 是TGFβ/Smad信號通路中組成部分, 在調控TGFβ1介導的細胞外基質積聚過程中起作用, 能介導TGFβ1信號轉導, 促進肝纖維化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受體激酶的底物, 兩者介導類似的信號且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同時使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信號轉運通路中的橋梁, 抑制它們的生成、核轉位和磷酸化, 進而抑制肝纖維化, 其中Smad3與肝纖維化的關系最為密切［6, 7］。

肝星狀細胞能產生HA, 其內皮細胞中降解, 肝纖維化時產生增加。肝纖維化時肝星狀細胞合成HA增加, 攝取降解減少, 是判定肝纖維化活動較敏感的指標［8, 9］。肝細胞受損后釋放出羥脯胺酸, 它是肝臟膠原蛋白獨有的氨基酸, 測定其含量, 可確定膠原總體含量, 可推算膠原增生與肝纖維化程度［10］。

本實驗隨著CCl4給藥時間的增長, 大鼠肝組織透明質酸和羥脯胺酸結果顯示, 模型組大鼠HA、Hyp數值升高, 中藥預防組和治療組, HA、Hyp數值也有所升高, 這三組與正常組相比P<0.01, 差異有統計學意義。本實驗說明隨著肝纖維化表現的加重, 肝組織內反映肝纖維化指標HA、Hyp的數值也相應升高, 而應用中藥可降低肝細胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3免疫組化染色顯示：模型組顯微鏡下陽性細胞數量及分布范圍明多于中藥治療組和預防組, 計算機光密度分析數據與鏡下觀測結論一致, 模型組與預防組和治療組比較差異有統計學意義(P<0.01)。這說明中藥軟肝寧是通過減少活化的星狀細胞分泌TGFβ1、減輕細胞的壞死和變性, 恢復肝功能, 抑制膠原沉積和生成, 抑制肝細胞內Smad2和Smad3蛋白質的表達和磷酸化, 減少TGFβ1表達, 抑制星狀合成膠和原［11］。由此研究可進一步得出結論：肝組織中Smad2/3蛋白質增多, TGFβ1分泌增加導致肝星狀細胞增殖, 它們之間正相關, 與相關文獻報道相似［7］。

本研究表明復方中藥方軟肝寧能延緩肝纖維化, 其機制可能是抑制TGFβ1表達其下游信號Smad2/3, 減少肝內膠原生成和沉淀, 減輕免疫損害, 降低肝臟的纖維化, 可臨床推廣價值此類復方中藥。

參考文獻

［1］ 趙輝平, 王勝春, 胡詠武, 等.五靈膠囊對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β/Smad及Ras/ERK信號通路蛋白的影響.胃腸病學和肝病學雜志, 2009, 18(5):392-396.

［2］ 陳爽, 張艷, 李孝生.川芎嗪對大鼠肝纖維化轉化生長因子阻、Smad 2/3表達的影響.胃腸病學和肝病學雜志, 2013, 22(10):971-973.

［3］ Wu XL, Zeng WZ, Jiang MD, et al. Effect of Oxymatrineon the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol, 2008, 14(13):2100-2105.

［4］ 黨雙鎖, 李亞萍.TGF-β1在肝纖維化研究中的新進展.世界華人消化雜志, 2010, 18(16):1631-1636.

［5］ Hamasaki K, Nakashima M , Naito S, et al. The sympathetic nervous system promotes carbon tetrachlo ride-induced liver cirrhosis in rats by supp ressing apop to sis and enhancing the grow thkinetics of regenerating hepatocytes. J Gast roenterol, 2001, 36(2):111.

［6］ 曹平, 劉立新, 郭曉紅, 等. Smad3沉默對IGFBPrPl誘導肝星狀細胞分泌細胞外基質作用的影響.中華肝膽外科雜志, 2011, 17(2):142-145.

［7］ Latella G, Vetuschi A, Sferra R, et al.Targeted disruption of Smad3 confers resistance to the development of dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in mice.Liver Int, 2009(29):997-1009.

［8］ 蔡衛民, 陶君, 翁紅雷, 等.血清纖維化指標的影響因素分析.中華肝臟病雜志, 2003, 11 (1) :23.

［9］ Oberti F, Valsesia E, Pilette C, et al. No invasive diagnosis of hepatic fibrosis or cirrhosis.Gastroenterology, 1997, 113(5):1609-1616.

［10］駱抗先.肝纖維化的血清學診斷.臨床肝膽病雜志, 1996, 12(1):1-2.

［11］Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, et al. Boswellia serrata and Salvia mihiorrhiza extracts reduce DMN-induced hepatic fibrosis in mice by TGF-betal downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11):1484-1498.

［收稿日期：2014-03-20］

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2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝組織中的表達與分布?陽性組織呈棕色, 陰性部分呈藍色。①A組肝組織: Smad2/3在正常肝細胞內, 匯管區基質及間質細胞胞漿內均無表達, TGFβ1在上述部位無表達, 在Disse 間隙偶有表達。②B組肝組織: 肝內TGFβ1、Smad2/3表達明顯強, TGFβ1表達極為強烈, 陽性細胞數目明顯增多, 主要見于小葉周圍擴大的纖維組織內的成纖維細胞、竇周細胞、炎性細胞以及增生的膽小管周圍梭狀細胞及肝細胞內, 陽性物質主要集中在胞漿內, 胞膜上也有少量表達。本組肝組織Smad2/3 表達主要集中在肝細胞胞漿內, 陽性細胞著色棕黃。③ C、D 組：TGFβ1、Smad2/3在肝組織內的表達量較B組減少, 陽性表達集中同B組, 陽性程度弱于B 組, D組表達明顯強于C組。各種成分在不同實驗組中表達經計算機軟件分析結果, 見表1, 圖1。

表1中藥對大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表達量化結果的影響( x-±s)

組別 例數 TGFβ1 Smad2/3

正常組 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型組 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

預防組 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治療組 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01；與治療組比較cP<0.05；與治療組比較dP>0.05

圖1?中藥對各組大鼠肝組織中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化結果的影響

2. 3中藥軟肝寧對CCl4肝纖維化大鼠肝組織的Hyp、HA影響試驗結束時模型組肝組織Hyp、HA數值遠遠高于正常組, 而中藥治療組和中藥預防組Hyp、HA數值低于模型組。各組與正常組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組、治療組與模型組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組觀察指標雖明顯優于治療組, 但兩者比較差異無統計學意義。具體結果見表2。

表2各組大鼠肝組織Hyp及HA比較( x-±s)

組別 例數 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常組 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型組 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治療組 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

預防組 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：與正常組比較bP<0.01, 與模型組比較aP<0.01, 與治療組比較cP>0.05

3討論

軟肝寧方劑中柴胡為君藥疏肝, 臣藥炒白術補脾, 再配以丹參、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中醫辨證治療纖維化原則。方中丹參能夠顯著抑制成纖維細胞的增生, 使星狀細胞凋亡［1］。川芎嗪能減少透明質酸和膠原產生, 并提高肝組織SOD的活性, 減少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 從而抑制肝星狀細胞活化, 減緩肝纖維增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纖維化機制是能增加肝血流量, 降低肝組織膠原含量, 促進肝內纖維膠原分解代謝［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纖維化的最重要細胞因子之一［4］。在肝臟中肝星狀細胞、肝細胞、枯否氏細胞、血小板等多種細胞產生此種因子, 可促進HSC活化并分泌多種膠原, 激活靜止狀態的HSC, 抑制細胞外基質( ECM)降解、進而抑制肝細胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信號在細胞內轉導的蛋白, 是TGFβ/Smad信號通路中組成部分, 在調控TGFβ1介導的細胞外基質積聚過程中起作用, 能介導TGFβ1信號轉導, 促進肝纖維化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受體激酶的底物, 兩者介導類似的信號且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同時使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信號轉運通路中的橋梁, 抑制它們的生成、核轉位和磷酸化, 進而抑制肝纖維化, 其中Smad3與肝纖維化的關系最為密切［6, 7］。

肝星狀細胞能產生HA, 其內皮細胞中降解, 肝纖維化時產生增加。肝纖維化時肝星狀細胞合成HA增加, 攝取降解減少, 是判定肝纖維化活動較敏感的指標［8, 9］。肝細胞受損后釋放出羥脯胺酸, 它是肝臟膠原蛋白獨有的氨基酸, 測定其含量, 可確定膠原總體含量, 可推算膠原增生與肝纖維化程度［10］。

本實驗隨著CCl4給藥時間的增長, 大鼠肝組織透明質酸和羥脯胺酸結果顯示, 模型組大鼠HA、Hyp數值升高, 中藥預防組和治療組, HA、Hyp數值也有所升高, 這三組與正常組相比P<0.01, 差異有統計學意義。本實驗說明隨著肝纖維化表現的加重, 肝組織內反映肝纖維化指標HA、Hyp的數值也相應升高, 而應用中藥可降低肝細胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3免疫組化染色顯示：模型組顯微鏡下陽性細胞數量及分布范圍明多于中藥治療組和預防組, 計算機光密度分析數據與鏡下觀測結論一致, 模型組與預防組和治療組比較差異有統計學意義(P<0.01)。這說明中藥軟肝寧是通過減少活化的星狀細胞分泌TGFβ1、減輕細胞的壞死和變性, 恢復肝功能, 抑制膠原沉積和生成, 抑制肝細胞內Smad2和Smad3蛋白質的表達和磷酸化, 減少TGFβ1表達, 抑制星狀合成膠和原［11］。由此研究可進一步得出結論：肝組織中Smad2/3蛋白質增多, TGFβ1分泌增加導致肝星狀細胞增殖, 它們之間正相關, 與相關文獻報道相似［7］。

本研究表明復方中藥方軟肝寧能延緩肝纖維化, 其機制可能是抑制TGFβ1表達其下游信號Smad2/3, 減少肝內膠原生成和沉淀, 減輕免疫損害, 降低肝臟的纖維化, 可臨床推廣價值此類復方中藥。

參考文獻

［1］ 趙輝平, 王勝春, 胡詠武, 等.五靈膠囊對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β/Smad及Ras/ERK信號通路蛋白的影響.胃腸病學和肝病學雜志, 2009, 18(5):392-396.

［2］ 陳爽, 張艷, 李孝生.川芎嗪對大鼠肝纖維化轉化生長因子阻、Smad 2/3表達的影響.胃腸病學和肝病學雜志, 2013, 22(10):971-973.

［3］ Wu XL, Zeng WZ, Jiang MD, et al. Effect of Oxymatrineon the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol, 2008, 14(13):2100-2105.

［4］ 黨雙鎖, 李亞萍.TGF-β1在肝纖維化研究中的新進展.世界華人消化雜志, 2010, 18(16):1631-1636.

［5］ Hamasaki K, Nakashima M , Naito S, et al. The sympathetic nervous system promotes carbon tetrachlo ride-induced liver cirrhosis in rats by supp ressing apop to sis and enhancing the grow thkinetics of regenerating hepatocytes. J Gast roenterol, 2001, 36(2):111.

［6］ 曹平, 劉立新, 郭曉紅, 等. Smad3沉默對IGFBPrPl誘導肝星狀細胞分泌細胞外基質作用的影響.中華肝膽外科雜志, 2011, 17(2):142-145.

［7］ Latella G, Vetuschi A, Sferra R, et al.Targeted disruption of Smad3 confers resistance to the development of dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in mice.Liver Int, 2009(29):997-1009.

［8］ 蔡衛民, 陶君, 翁紅雷, 等.血清纖維化指標的影響因素分析.中華肝臟病雜志, 2003, 11 (1) :23.

［9］ Oberti F, Valsesia E, Pilette C, et al. No invasive diagnosis of hepatic fibrosis or cirrhosis.Gastroenterology, 1997, 113(5):1609-1616.

［10］駱抗先.肝纖維化的血清學診斷.臨床肝膽病雜志, 1996, 12(1):1-2.

［11］Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, et al. Boswellia serrata and Salvia mihiorrhiza extracts reduce DMN-induced hepatic fibrosis in mice by TGF-betal downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11):1484-1498.

［收稿日期：2014-03-20］

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2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝組織中的表達與分布?陽性組織呈棕色, 陰性部分呈藍色。①A組肝組織: Smad2/3在正常肝細胞內, 匯管區基質及間質細胞胞漿內均無表達, TGFβ1在上述部位無表達, 在Disse 間隙偶有表達。②B組肝組織: 肝內TGFβ1、Smad2/3表達明顯強, TGFβ1表達極為強烈, 陽性細胞數目明顯增多, 主要見于小葉周圍擴大的纖維組織內的成纖維細胞、竇周細胞、炎性細胞以及增生的膽小管周圍梭狀細胞及肝細胞內, 陽性物質主要集中在胞漿內, 胞膜上也有少量表達。本組肝組織Smad2/3 表達主要集中在肝細胞胞漿內, 陽性細胞著色棕黃。③ C、D 組：TGFβ1、Smad2/3在肝組織內的表達量較B組減少, 陽性表達集中同B組, 陽性程度弱于B 組, D組表達明顯強于C組。各種成分在不同實驗組中表達經計算機軟件分析結果, 見表1, 圖1。

表1中藥對大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表達量化結果的影響( x-±s)

組別 例數 TGFβ1 Smad2/3

正常組 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型組 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

預防組 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治療組 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：與正常組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01；與治療組比較cP<0.05；與治療組比較dP>0.05

圖1?中藥對各組大鼠肝組織中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化結果的影響

2. 3中藥軟肝寧對CCl4肝纖維化大鼠肝組織的Hyp、HA影響試驗結束時模型組肝組織Hyp、HA數值遠遠高于正常組, 而中藥治療組和中藥預防組Hyp、HA數值低于模型組。各組與正常組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組、治療組與模型組比較, 差異具有統計學意義(P<0.01), 預防組觀察指標雖明顯優于治療組, 但兩者比較差異無統計學意義。具體結果見表2。

表2各組大鼠肝組織Hyp及HA比較( x-±s)

組別 例數 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常組 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型組 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治療組 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

預防組 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：與正常組比較bP<0.01, 與模型組比較aP<0.01, 與治療組比較cP>0.05

3討論

軟肝寧方劑中柴胡為君藥疏肝, 臣藥炒白術補脾, 再配以丹參、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中醫辨證治療纖維化原則。方中丹參能夠顯著抑制成纖維細胞的增生, 使星狀細胞凋亡［1］。川芎嗪能減少透明質酸和膠原產生, 并提高肝組織SOD的活性, 減少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 從而抑制肝星狀細胞活化, 減緩肝纖維增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纖維化機制是能增加肝血流量, 降低肝組織膠原含量, 促進肝內纖維膠原分解代謝［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纖維化的最重要細胞因子之一［4］。在肝臟中肝星狀細胞、肝細胞、枯否氏細胞、血小板等多種細胞產生此種因子, 可促進HSC活化并分泌多種膠原, 激活靜止狀態的HSC, 抑制細胞外基質( ECM)降解、進而抑制肝細胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信號在細胞內轉導的蛋白, 是TGFβ/Smad信號通路中組成部分, 在調控TGFβ1介導的細胞外基質積聚過程中起作用, 能介導TGFβ1信號轉導, 促進肝纖維化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受體激酶的底物, 兩者介導類似的信號且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同時使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信號轉運通路中的橋梁, 抑制它們的生成、核轉位和磷酸化, 進而抑制肝纖維化, 其中Smad3與肝纖維化的關系最為密切［6, 7］。

肝星狀細胞能產生HA, 其內皮細胞中降解, 肝纖維化時產生增加。肝纖維化時肝星狀細胞合成HA增加, 攝取降解減少, 是判定肝纖維化活動較敏感的指標［8, 9］。肝細胞受損后釋放出羥脯胺酸, 它是肝臟膠原蛋白獨有的氨基酸, 測定其含量, 可確定膠原總體含量, 可推算膠原增生與肝纖維化程度［10］。

本實驗隨著CCl4給藥時間的增長, 大鼠肝組織透明質酸和羥脯胺酸結果顯示, 模型組大鼠HA、Hyp數值升高, 中藥預防組和治療組, HA、Hyp數值也有所升高, 這三組與正常組相比P<0.01, 差異有統計學意義。本實驗說明隨著肝纖維化表現的加重, 肝組織內反映肝纖維化指標HA、Hyp的數值也相應升高, 而應用中藥可降低肝細胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3免疫組化染色顯示：模型組顯微鏡下陽性細胞數量及分布范圍明多于中藥治療組和預防組, 計算機光密度分析數據與鏡下觀測結論一致, 模型組與預防組和治療組比較差異有統計學意義(P<0.01)。這說明中藥軟肝寧是通過減少活化的星狀細胞分泌TGFβ1、減輕細胞的壞死和變性, 恢復肝功能, 抑制膠原沉積和生成, 抑制肝細胞內Smad2和Smad3蛋白質的表達和磷酸化, 減少TGFβ1表達, 抑制星狀合成膠和原［11］。由此研究可進一步得出結論：肝組織中Smad2/3蛋白質增多, TGFβ1分泌增加導致肝星狀細胞增殖, 它們之間正相關, 與相關文獻報道相似［7］。

本研究表明復方中藥方軟肝寧能延緩肝纖維化, 其機制可能是抑制TGFβ1表達其下游信號Smad2/3, 減少肝內膠原生成和沉淀, 減輕免疫損害, 降低肝臟的纖維化, 可臨床推廣價值此類復方中藥。

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［收稿日期：2014-03-20］

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