KLK6、KLK10在結直腸癌的表達及與臨床病理的關系

呂 洋 李鳳玉 任君旭 劉 博

(河北北方學院基礎醫學院組胚教研室，河北 張家口 075000)

人組織激肽釋放酶家族(KLKs)是胰凝乳蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的亞家族，廣泛存在于人體多種生理組織和體液中。KLK6及KLK10均是KLKs的成員。近來研究發現，KLK6及KLK10參與包括結直腸癌存在的多種腫瘤的發生發展〔1～4〕。本研究應用免疫組織化學方法，檢測二者在結直腸腺癌、腺瘤和正常結直腸黏膜組織中的表達，回顧性研究KLKs與結直腸癌臨床病理的關系及可能機制。

1 材料和方法

1.1研究對象 采用隨機法從河北北方學院附屬第一醫院病理科2008年1月1日至2011年12月31日手術切除原發性結直腸腺癌437例石蠟包埋標本中選取57例，所有患者術前均未經過任何治療且均有完整的臨床病理資料。入選病例有無淋巴結轉移明確，無淋巴結轉移病例要求送檢淋巴結數目≥12枚，淋巴結轉移病例至少有1枚淋巴結被病理證實有癌轉移。同時選取結直腸腺瘤石蠟標本21例，距癌組織>5 cm的正常黏膜組織共11例作為對照，對照標本經病理證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯炎癥，無明顯細胞增生等病變。57例結直腸癌標本中，男33例，女24例，年齡22～78歲，中位年齡56.0為，平均年齡為55.2歲。腫瘤直徑≤5 cm的31例(54.4%)，>5 cm的26例(45.6%)；分化程度為高分化的14例，中分化22例，低分化21例；TNM分期為Ⅰ期的5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期22例；Ⅳ期13例。

1.2試劑及方法 兔抗人KLK6多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、兔抗人KLK10多克隆抗體(工作濃度為1∶200)均購自北京博奧森生物技術有限公司；S-P試劑盒、檸檬酸抗原修復緩沖液、 PBS緩沖液、抗體稀釋液、DAB顯色劑均購自石家莊勃盛化學試劑有限公司。按照S-P免疫組化檢測試劑盒中的操作方法并用高壓鍋抗原修復技術檢測KLK6及KLK10在結直腸癌中的表達。PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3結果判斷 KLK6及KLK10的蛋白陽性產物均主要表達于細胞質。出現灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細胞，依陽性細胞占所觀察細胞的百分比及著色強度綜合計分〔5〕。由兩位病理醫師分別雙盲閱片，隨機選取5個高倍鏡視野計數陽性細胞百分比的平均數，按腫瘤細胞陽性細胞數量記為0～3分，陽性細胞數目為<10%為0分，10%～49%為1分，50%～74%為2分，≥75%為3分；著色強度記為0～3分，無色為0分，灰黃色為1分，金黃色為2分，棕黃色為3分；將兩項指標的評分相加，根據總的分數分為2級，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1KLK6及KLK10在不同結直腸黏膜組織中的表達情況 與陰性對照實驗結果相比，KLK6及KLK10在正常結直腸黏膜組織中多呈陰性表達，在腺瘤組織中表達增強，在結直腸腺癌中表達明顯(圖1)。KLK6及KLK10在結直腸腺癌的陽性率分別為52.6%和66.7%，在結直腸腺瘤的陽性率分別為33.3%和38.1%，在正常結直腸黏膜組織中的陽性率為9.1%和27.3%。KLK6及KLK10在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常結直腸黏膜組織中的表達均具有顯著差異(χ2=8.129和8.978，P均<0.05)。見表1。

2.2KLK6及KLK10的表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系 見表2。KLK6及KLK10的表達均與患者的TNM分期、淋巴結轉移及肝轉移情況相關(P均<0.05)。TNM分期高、伴有淋巴結轉移及肝轉移的患者KLK6及KLK10的表達均強。此外，KLK6還與腫瘤的分化程度相關，低分化的結直腸癌KLK6蛋白表達高(P=0.015)。而KLK6及KLK10的陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小等均不相關(P均>0.05)。

正常結直腸黏膜KLK6

結直腸腺瘤KLK6

結直腸腺癌KLK6

陰性對照組

正常結直腸黏膜KLK10

結直腸腺瘤KLK10

結直腸腺癌KLK10

圖1各種結直腸黏膜組織KLK6、KLK10表達(SP，×200)

表1 KLK6和KLK10在結直腸腺癌、腺瘤和正常黏膜組織中的表達〔n(%)〕

表2 KLK6和KLK10陽性表達與臨床病理情況的關系

2.3KLK6及KLK10在結直腸癌表達的相互關系 KLK6及KLK10在結直腸癌的表達呈正相關(r=0.745)。KLK10在KLK6陽性組中的表達(陽性率100%)明顯高于在KLK6陰性組中的表達(陽性率29.6%)。

3 討 論

研究發現，KLKs參與多種腫瘤的發生發展，主要方式為通過其編碼的hK蛋白直接或間接的降解腫瘤細胞外基質蛋白如膠原蛋白，纖連黏連蛋白，層黏連蛋白等，從而促進腫瘤細胞的遷移、腫瘤新生血管的形成。

KLK6基因是KLKs成員之一，編碼由223個氨基酸組成、具有胰蛋白酶樣活性的hK6蛋白。國外學者通過EST數據庫分析發現KLK6在女性生殖系統如卵巢、子宮和消化系統如食管、胃、胰腺等腫瘤中表達上調，在乳腺和腦部腫瘤中表達下調〔6〕。關于KLK6與結直腸癌的研究，Ogawa等〔7〕采用RT-PCR技術發現結直腸癌組織中 KLK6 mRNA表達水平明顯高于正常組織， KLK6 mRNA高表達與腫瘤漿膜浸潤、肝轉移、臨床分期、預后差相關。Kim等〔8〕研究發現， KLK6 mRNA在結直腸癌患者組織及血清中的表達水平顯著增高，且與患者的預后不良密切相關。本研究結果顯示，KLK6在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常結直腸黏膜組織中的表達具有顯著差異。進一步與臨床病理的關聯研究發現，KLK6的表達與患者的TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移情況及腫瘤的分化程度相關。分化程度低、TNM分期高、伴有淋巴結轉移及肝轉移的患者KLK6的表達均強，這一結果與Petraki等〔9〕的結果一致。

KLK10基因位于19號染色體q13.4位置上， 含6個外顯子(其中一個未被翻譯)和5個內含子，編碼一條分子量約為30 kD的含276 個氨基酸的蛋白。近年大量研究顯示，在激素相關性組織發生的腫瘤如乳腺癌、前列腺、睪丸癌中KLK10 表達異常，多數病例表達下降，也有少數表達異常升高，高表達則提示預后不良〔10〕。KLK10在激素相關性組織發生的腫瘤中異常表達可能與性激素分泌失衡相關〔11〕。此外，有學者發現KLK10在結直腸癌中也呈異常高表達，且與結直腸癌患者的腫瘤分期及肝臟轉移密切相關〔12，13〕。本研究結果顯示，KLK10在結直腸腺癌、腺瘤及正常結直腸黏膜組織中的表達具有顯著性差異。伴有淋巴結及肝臟轉移、TNM分期越高的患者KLK10的表達越強。而KLK10陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等均不相關。

近年來研究發現，KLK6及KLK10基因在多種腫瘤中表達結果相一致，如在前列腺癌中KLK6及KLK10的表達均下調〔14〕，在卵巢癌組織中二者則均呈過表達〔15〕。在乳腺癌和淋巴細胞白血病中KLK6及KLK10的表達異常均是由于二者高度甲基化的CpG島引起的〔16〕。本研究結果也顯示，KLK6及KLK10在結直腸癌的表達呈正相關，KLK10在KLK6陽性組中的表達率明顯高于在KLK6陰性組中的表達率。由此推測在KLKs中，KLK6及KLK10在惡性腫瘤的發生發展中可能起到了協同作用，但具體機制仍不清楚，仍需要進一步的研究。

綜上所述，KLK6及KLK10參與結直腸癌的發生發展并與結直腸癌的淋巴結轉移、肝轉移及TNM分期相關，可作為較為理想的腫瘤標志物輔助判斷患者預后并指導臨床治療。

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