外源性堿性成纖維細胞生長因子對Ⅲ級靜脈炎模型兔VEGF表達的影響

黃利全 陳 黎 毛宇飛 姜麗萍 陳桂園

(金華職業技術學院醫學院，浙江 金華 321017)

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)能促進手術、外傷、炎癥、潰瘍等導致的組織和上皮的修復與再生，促進傷口的無瘢痕復原〔1，2〕。大量研究證實，bFGF在創傷領域療效顯著，對新生血管的形成起效較快〔3〕，對心腦血管的損傷具有保護作用，但對靜脈炎癥導致血管損傷的作用未見報道。臨床資料顯示，靜脈炎是患者輸液反應的常見并發癥，發生率高達80%〔4〕，其中Ⅲ級靜脈炎發生率為21.6%〔5〕。一旦發生Ⅲ級靜脈炎，患者血管嚴重損傷，甚至導致菌血癥的發生〔6，7〕，而當前對重度靜脈炎的治療效果并不理想。本研究探討bFGF對Ⅲ級靜脈炎修復的作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 一次性靜脈留置針(型號24G×19 mm)及3M透明敷貼分別由美國BD公司及3M公司生產；20%甘露醇產自華潤雙鶴藥業股份有限公司；bFGF購自美國PeproTech 公司，50 μg/支。Leica DM 2000光學顯微鏡產自德國Leica公司； UCMOS09000KPA顯微鏡CCD成像系統產自杭州圖譜光電科技有限公司。

1.2建模與分組 選健康新西蘭同種家兔42只，體重2.5～3.0 kg，雌雄各半，由金華市實驗動物中心提供〔生產許可證號：SYXK(浙)2010-0151〕，單籠飼養，隨機編號、排序。按隨機數字表法分5組：bFGF組、硫酸鎂組、生理鹽水組各12只；正常組、模型組各3只。正常組行剃毛和雙耳包扎，余4組取兔雙耳外緣靜脈為實驗血管，由專人統一操作，用24G留置針一次穿刺成功后3M透明貼及自制兔套固定。每日在15 min內推注20%甘露醇10 ml，常規肝素鹽水2 ml(25 U/ml)正壓封管，觀察穿刺血管情況，形成Ⅲ級靜脈炎為建模成功。預實驗示建模成功時間為5 d，故留置5 d后拔管，未達Ⅲ級靜脈炎者廢棄、重新補入。

1.3干預與標本制作 建模成功后拔靜脈留置針， bFGF組于拔管日在炎癥靜脈右側旁開0.25 cm處皮下注射bFGF 0.8 μg/kg 1次。硫酸鎂組及生理鹽水組分別用50%硫酸鎂或生理鹽水的六層濕紗布(以不滴水為度)覆蓋靜脈炎局部，3次/d，15 min/次，一旦紗布變干馬上更換。正常組、模型組于拔管日，余三組在用藥后24、72、120、168 h分別提取標本。各時相各取3只家兔在苯巴比妥鈉腹腔麻醉下提取活體標本，以穿刺點及留置針套管末端為中心，截取長、寬各0.5 cm的兩段標本，經10%中性甲醛液固定24 h 后, 常規制蠟，連續切片。每張切片厚度約2～5 μm,其中第4張切片行血管內皮生長因子(VEGF)檢測，前后連續的5張切片行HE染色。

1.4病理觀察與免疫組化檢測 HE染色后由病理科醫生鏡下觀察血管內皮腫脹、炎細胞浸潤、管壁增厚、纖維增生、血栓形成等情況。

一抗VEGF兔抗多克隆抗體，二抗聚合HRP標記抗兔IgG，SV試劑盒(含DAB顯色劑)均購自武漢博士德生物技術公司。一抗稀釋倍數為1∶100，嚴格按照試劑說明書步驟操作。免疫組化結果判定， VEGF陽性表達位于細胞質，出現明顯的黃色和棕黃色為陽性細胞。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染。陽性細胞計數參照王艷艷等〔8〕的觀察法，每組隨機選取5張切片，每張切片隨機選取5個不重疊的高倍視野(×200)，計數視野中的陽性細胞總數，計算每組平均每個高倍視野中的陽性細胞數。

2 結 果

2.1病理學表現 bFGF組用藥后24 h血管腔內少見血栓，內皮細胞增生明顯；120 h新生的內皮細胞相互連接成完整的內皮，血管腔內血栓及炎性滲出物吸收，基本恢復正常。硫酸鎂組120 h血管腔內炎性細胞減少，新生內皮細胞少；168 h炎癥消退較明顯。生理鹽水組120 h管腔內炎性細胞仍明顯，168 h炎癥略有消退。正常組血管壁光滑，無炎癥細胞浸潤。模型組血管壁被大量淋巴細胞、組織細胞侵蝕，肌纖維母細胞增生，血管腔內混合血栓形成，管腔周圍炎性細胞浸潤(圖1)。

2.2VEGF蛋白的表達 VEGF陽性表達主要集中在內皮細胞的胞質中。bFGF組VEGF表達強陽性，24 h最高，72～120 h表達處于一個較高水平，168 h VEGF陽性表達下降，與模型組、硫酸鎂組及生理鹽水組間兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)。硫酸鎂組VEGF表達量24 h較多，其余時相與生理鹽水組相近均為陰性表達，與bFGF組比較有統計學差異(P<0.05)。正常組、模型組VEGF弱陽性表達，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖2，表1)。

A:正常組;B:模型組;C:bFGF組(24 h);D: bFGF組(120 h);E:硫酸鎂組(120 h);F:生理鹽水組(120 h)

圖2 靜脈炎各組VEGF表達情況(SP，×200)

組別24 h72 h120 h168 hbFGF組73.40±1.821)2)50.40±5.131)2)57.20±5.811)2)37.20±2.781)2)破酸鎂組32.00± 8.091)20.00±1.2315.80±1.4819.40±2.51生理鹽水組16.60±3.5820.20±2.6821.80±0.8411.80±1.30F值158.6207.173205.131162.382 P值0.0000.0090.0000.000

3 討 論

Ⅲ級靜脈炎屬于重度靜脈炎，肉眼可見輸液部位疼痛伴有發紅或水腫，可觸及條索狀靜脈，臨床處理較棘手。本研究采用靜脈留置針的機械刺激與20%甘露醇的高滲透刺激雙重作用下誘導建立除疼痛因素外的Ⅲ級靜脈炎動物模型，為該級靜脈炎的病理觀察及不同藥物的干預研究提供了可能。實驗發現雙重因素作用下Ⅲ級靜脈炎的形成時間約為5 d，與梁月香等〔9〕的臨床觀察結果相似。此時除肉眼變化外病理可見血管腔內大量炎癥細胞浸潤，混合血栓形成，內皮細胞壞死脫落，血管壁增厚。因正常內皮細胞具有抗炎抗凝屬性〔10〕，一旦受損即致炎癥反應發生及血栓形成，故損傷部位血管的再內皮化是靜脈炎修復的關鍵。

本研究結果顯示bFGF加速了修復的進程，縮短了治愈時間。盡管正常血管內膜損傷時也能分泌bFGF，但分泌量不足，修復進程緩慢需1～2 w。當加用外源性bFGF時，增加了局部bFGF含量并通過激活內源性生長因子活性或上調生長因子受體表達〔11〕，使VEGF分泌量驟升。VEGF作為促血管生成的生長因子，受缺氧及其他因素的影響，由內皮細胞、成纖維細胞、血小板、中性粒細胞及巨噬細胞等分泌產生，具有促進內皮細胞有絲分裂、趨化等功能。Ⅲ級靜脈炎時，局部血管缺氧，再加bFGF與VEGF的正協同作用〔12〕，加速了血管內膜的內皮化，抑制了血栓的形成〔13〕。

本文VEGF的表達高峰時間與Brown等〔14〕和Frank等〔15〕報道VEGF表達高峰時間與損傷程度相關的結果相符，可見Ⅲ級靜脈炎損傷較嚴重。本文中bFGF組高水平的VEGF維持時間顯著長于硫酸鎂組，分析原因可能與內源性bFGF迅速處于低值有關〔16，17〕,此時主要依賴外源性bFGF誘導VEGF表達。盡管硫酸鎂組VEGF的整體表達量不高，但靜脈炎癥消退仍較明顯，其作用機制可能是通過其高滲性及Mg2+擴張局部血管而達到消腫作用。本實驗中生理鹽水組VEGF分泌量低下，這與文獻結果認為損傷早期以VEGF表達為主〔18〕不符合，分析原因可能與炎癥早期Ⅲ級靜脈炎損傷嚴重，導致VEGF表達欠佳有關，又可能與損傷晚期以內源性bFGF表達為主有關〔18〕。

綜上所述，bFGF與硫酸鎂對Ⅲ級靜脈炎均有修復作用，bFGF優于硫酸鎂。其作用機制可能是Ⅲ級靜脈炎時血管內皮細胞嚴重受損，激活了巨噬細胞，導致炎癥細胞浸潤、內皮細胞壞死脫落。bFGF通過激活內源性生長因子活性或上調生長因子受體表達, 進而協同VEGF共同發揮促進血管內皮細胞增生的功能。

4 參考文獻

1Sadanori Akita, Kozo Akino, Akiyoshi Hirano.Basic fibroblast growth factor in scarless wound healing〔J〕. Adv Wound Care,2013;2:44-9.

2Akasaka Y, Ono I, Yamashita T,etal. Basic fibroblast growth factor promotes apoptosis and suppresses granulation tissue formation in acute incisional wounds〔J〕.J Pathol,2004;203:710-20.

3Ogawa K, Asonuma K, Inomata Y,etal. The efficacy of prevascularization by basic FGF for hepatocyte transplantation using polymer devices in rats〔J〕.Cell Transplant,2001;10:7239.

4司馬欣元.輸液致靜脈炎的防治和護理進展〔J〕.解放軍護理雜志,2009;26(8A):48-9.

5Uslusoy E, Mete S. Predisposing factors to phlebitis in patients with peripheral intravenous catheters:a descriptive study 〔J〕. Am Acad Nurse Prac,2008;20:172-80.

6Lee WL. Soft tissue infections related to peripheral intravenous catheters in hospitalized patients: a case-control study〔J〕.J Hospital Inf,2010;76:124-9.

7陳蓮花.循證護理在預防靜脈留置針并發癥中的應用〔J〕.護士進修雜志，2009;24(1)：42.

8王艷艷，張純瑜，孫 艷，等.氧化應激反應及細胞凋亡與早期壓瘡形成的關系研究〔J〕.中華護理雜志，2011;46(5):508-9.

9梁月香，卞素琴.使用動靜脈留置針滴甘露醇的護理體會〔J〕.護士進修雜志，1997；12(9):39.

10Fuke S, Maekawa K, Kawamoto K,etal. Impaired endothelial vasomotor function after sirolimus-eluting stent implantation〔J〕. Circ J,2007;71:220-5.

11Boulfon AJM. Clinical promise of becaplermin gel:diabetic foot ulcer 18th Amual Meeting of the European〔J〕. Tissue Rapair Soc,1998;37:27-30.

12胡以信，袁 杰，鄒 勇,等.富血小板血漿在促進兔燙傷創面愈合中 bFGF VEGF 的表達及意義〔J〕.重慶醫學，2013;42(35)：4297-8.

13邢麗菊.復脈膏防治化療性靜脈炎的臨床研究及對VEGF、EGFR影響的實驗研究〔D〕.南京：南京中醫藥大學,2012.

14Brown LF, Yeo KT, Berse B,etal. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound healing〔J〕. J Exp Med,1992;176(5):1375-9.

15Frank S, Hubner G, Breier G,etal. Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes. Implications for normal and impaired wound healing〔J〕. J Biol Chem,1995，26;270(21):12607-13.

16Nissen NN, Polverini PJ, Koch AE,etal. Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activity during the proliferative phase of wound healing〔J〕. Am J Pathol,1998;152:1445-52.

17Nissen NN, Polverini PJ, Gamelli RL,etal. Basic fibroblast growth factor mediates angiogenic activity in early surgical wounds〔J〕. Surgery,1996;119(4)：457-65.

18Bao P, Kodra A,Tomic-Canic M,etal. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing〔J〕. J Surg Res,2009;153(2):347-58.