老年子宮內膜癌組織中突變型p53基因表達與血管內皮生長因子的關系

王曉冰

(內蒙古林業總醫院，內蒙古 牙克石 022150)

子宮內膜癌是婦科臨床常見的惡性腫瘤，發病率逐年上升，分子生物學研究認為，信號傳導系統的缺陷和異常活化導致腫瘤凋亡抑制和增殖異常活化是腫瘤發生的主要機制〔1〕，導致腫瘤的發生和發展成為眾多研究者關注的熱點，已有研究〔2〕表明正常的p53基因編碼53 kD的蛋白，在細胞周期中起重要的調節作用，對細胞癌變有抑制作用，當該基因發生點突變，缺失和滅活時，即由野生型轉變為突變型，從而促進腫瘤的發生和發展。突變型p53基因在子宮內膜癌的發生發展中有重要的意義〔3，4〕。本研究探討血管內皮生長因子(VEGF)與突變型p53基因在子宮內膜癌組織中的表達及相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集我院2007年10月至2010年10月門診及住院處就診的原發性子宮內膜癌患者術后標本50例，病變組織浸泡于10%甲醛溶液中，常規石蠟包埋。年齡60～83〔平均(71.5±3.6)〕歲。平均孕次(2.93±1.20)次，平均產次(2.0±1.5)次。所有病例診斷經病理證實。全部病例組織學分類和手術病理分期按照2009年國際婦產科聯盟(FIGO)標準進行。手術病理分期：Ⅰ期～Ⅱ期33例，Ⅲ期以上17例；組織學分類：高分化(G1)19例，中分化(G2)18例，低分化(G3)13例。肌層浸潤深度>1/2者14例，≤1/2者36例。同時選取50例正常增生期子宮內膜組織作對照，年齡60～85〔平均(70.8±4.2)〕歲。平均孕次(2.58±1.30)次，平均產次(2.2±1.6)次。兩組年齡、孕次、產次等一般資料比較無差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑和儀器 鼠抗人p53單克隆抗體，兔抗人多克隆抗體VEGF,SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自Bioworld生物科技公司，抗體稀釋濃度均為1∶100。以PBS代替一抗作為空白對照。

1.3試驗方法 選取組織標本均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，采用SP法免疫組織化學染色法檢測。免疫組化步驟按SP試劑盒說明書操作。將標本石蠟組織切片進行常規脫蠟、水洗、孵育(加過氧化氫)20 min，再一抗孵育90 min，進行PBS液緩沖后在進行二抗孵育60 min，再次進行PBS液緩沖，加辣根過氧化酶復合物孵育60 min后DAB顯色，鏡下蘇木素染色、水洗、脫水、透明，中性樹膠封固而染色成片。

1.4判定標準 顯微鏡下觀察，p53陽性染色主要在腫瘤細胞核的棕色染色為準，>10%為陽性；VEGF主要在細胞質中表達,先用低倍鏡閱片，再用高倍鏡選取5個高倍視野，首先將染色強度打分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色深淺需與背景著色相對比。再將陽性細胞所占的百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細胞<10%，2分為陽性細胞11%～50%，3分為陽性細胞51%～80%，4分為陽性細胞≥81%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>6分為高表達，<6分為低表達〔5〕。

1.5統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗，相關分析采用Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1不同子宮內膜癌組織突變型p53及VEGF蛋白的表達 突變型p53、VEGF蛋白在子宮內膜癌組織的表達陽性率均顯著高于正常子宮內膜(χ2=8.682、6.703，P<0.01)。見表1。

2.2子宮內膜癌臨床病理特征與p53及VEGF蛋白表達的相關性 子宮內膜癌組織中p53表達與腫瘤組織學分級、臨床分期、肌層浸潤深度及淋巴結轉移顯著相關(χ2=5.028、6.657、5.502、11.293，P<0.05)；VEGF蛋白在子宮內膜癌組織中的表達與臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移顯著相關(χ2=4.566、4.098、9.305，P<0.05)；VEGF蛋白的表達與子宮內膜癌肌層浸潤深度無明顯相關性(χ2=0.374，P>0.05)。見表2。

表1 不同子宮內膜組織突變型p53及VEGF蛋白的表達(n,n=50)

表2 子宮內膜癌臨床病理特征與p53及VEGF蛋白表達的關系〔n(%)〕

2.3子宮內膜癌P53及VEGF蛋白的表達相關性 Spearman等級相關分析顯示，子宮內膜癌組織中VEGF與p53蛋白的表達呈顯著的正相關關系(r=0.482，P<0.01)。

3 討 論

p53是腫瘤的克星。當細胞核中的DNA受損時，p53或者阻止非正常細胞復制，直到DNA被修復，或者引導“細胞自殺”。大部分癌癥都是缺陷基因引起的，p53變異是常見的基因缺陷。p53基因與細胞的分化、凋亡、DNA修復密切相關，分為野生型(WTP53)和突變型兩種〔6〕。P53的突變和缺失，是許多腫瘤發生的重要原因之一。各種腫瘤均有各自的惡變階段，如結腸息肉癥、胃黏膜不典型增生、化生和萎縮性胃炎、慢性肝炎、肝硬化、乳腺增生、慢性鼻炎、慢性宮頸炎等，均為癌前病變。有癌前病變人群患腫瘤的概率高于正常人群〔7〕。主要原因是由于炎癥的長期浸潤，病變部位的DNA受損細胞遠多于正常部位，這增加對抑癌基因p53的要求。但炎癥也同樣會損傷p53基因，致其突變，造成癌前病變部位的p53表達反而更少。因此，增強野生型p53基因在細胞中的表達，是癌前病變患者防癌的重要手段〔8〕。抑癌基因p53 編碼核磷酸蛋白，具有調節轉錄、抑制細胞生長、誘導凋亡的作用。p53 基因突變后失去正常抑癌作用，可促進細胞惡性轉化。在發生突變時，其半衰期延長，可通過免疫組化染色檢測到，呈細胞核表達〔9〕。本研究結果顯示組織學分級越高，p53 陽性表達率越高。突變型p53、VEGF蛋白在子宮內膜癌組織的表達陽性率均顯著高于正常子宮內膜,提示p53 基因突變與細胞惡性程度上升有關，可能與腫瘤組織學分級、臨床分期、肌層浸潤深度及淋巴結轉移相關。p53 的突變在子宮內膜癌的發生發展中具有重大意義，利用p53 對早期子宮內膜癌的診斷及失去手術機會，對放、化療不敏感的晚期子宮內膜癌治療有潛在價值。這應是子宮內膜癌診治研究的其中一個重要方向。腫瘤組織中新生血管形成是在腫瘤現有的血液供應基礎上產生新的血管，這些新生血管可以為腫瘤細胞提供養分，從而促進腫瘤細胞增殖、生長、擴散和轉移，是腫瘤組織生長有別于其他正常組織的特征。

VEGF可在乳腺癌組織細胞中檢測到〔10〕，具有以下生物學功能：①促進內皮細胞增殖與遷徙，從而刺激新生血管生成；②增加血管通透性；③抑制乳腺癌細胞凋亡發生；④抑制樹突狀細胞的成熟。新生血管生成是活體組織在已經存在的微血管床上芽生出以新生毛細血管為主的血管系統過程，是腫瘤賴以生長和轉移的基礎。在沒有血管為腫瘤細胞提供營養，腫瘤細胞就會很快凋亡，腫瘤大小一般也超不過2～3 mm3。新生血管不僅僅為腫瘤組織提供營養，而且還為腫瘤細胞的轉移提供方式〔11〕。子宮內膜癌細胞的生長、增殖以及轉移和其他實體腫瘤細胞一樣，依賴于腫瘤血管形成，新生血管生成是腫瘤生長的必備條件〔12〕。本研究結果顯示VEGF蛋白在子宮內膜癌組織的表達陽性率均顯著高于正常子宮內膜，VEGF蛋白在子宮內膜癌組織中的表達與臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移顯著相關。VEGF 是調控血管生成的主要因子，主要是特異性作用于血管內皮細胞，促進有絲分裂，使新生血管形成，增加血管通透性，加快腫瘤生長與轉移。有研究表明，VEGF 同腫瘤大小、TNM 分期、組織學分級、淋巴轉移呈正相關關系〔13〕。VEGF 是受缺氧條件調控的血管生成調節因子，缺氧情況下腫瘤細胞的增殖會加速，腫瘤細胞微環境中，缺氧狀態可以導致血管結構及功能異常。VEGF作為正常機體組織中促進血管生成的重要因子，在機體組織細胞受到損傷后具有促進新生血管生成，加速受損組織細胞恢復，但在腫瘤組織中，由于正常生理平衡受到破壞，病理狀態下VEGF 對腫瘤中新生血管的生成同樣具有重要作用，貫穿于腫瘤生長、轉移過程的始終〔14〕。綜上所述，子宮內膜癌組織中VEGF與p53蛋白的表達呈顯著的正相關關系。子宮內膜癌細胞組織分級特征與p53、VEGF蛋白表達的相關性提示p53、VEGF可能成為子宮內膜癌預后因子，因此，聯合檢測p53、VEGF為評估子宮內膜癌的生物學行為、分化程度和判斷預后提供依據，對指導子宮內膜癌的早期診斷及治療有重要價值。

4 參考文獻

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistica〔J〕.CA Cancer J Clin，2007；57(1)：43-66.

2周 琦，田桂蘭，肖 覺，等.子宮內膜癌p53表達的臨床意義研究〔J〕.腫瘤防治雜志，2003；10(8)：825-7.

3張育軍，魏麗惠，王建六.腫瘤抑癌蛋白PTEN、P53在子宮內膜癌組織中的表達〔J〕.中國婦產科臨床，2001;2(4):230-2.

4魏志敏，姜天福，孫顯路，等.子宮內膜樣腺癌p53、c-erbB2 CD44v6和雌孕激素受體聯合檢測的臨床意義〔J〕.青島大學醫學院學報，2004；40(1)：42-3.

5Ioffeo B，Papadimitriou JC，Drachenberg CB.Correlation of proliferation indices，apoptosis，and related on-cogene expression(bcl-2 and c′erbIB2)and p53 in proliferative，hyperplastic， and malignant endometrium〔J〕. Hum Pathol，1998；29(10)：1150-9.

6許 斌,張春蕾,韓 冬.子宮內膜癌PTEN蛋白及P53蛋白的異常表達〔J〕.中國體視學與圖像分析,2007；12(1):16.

7古吉敏,華 平,李天永.PTEN蛋白及P53蛋白在子宮內膜癌中的異常表達〔J〕.四川醫學,2008；29(11):1527.

8仰 晨,吳元赭,李桂梅.PTEN和P53蛋白在子宮內膜癌中的表達及臨床意義〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2007；12(7):505.

9耿 蕾，崔竹梅，李玉軍，等.HIF 1a、VEGF及IGF-I蛋白在子宮內膜癌中的表達及其意義〔J〕.齊魯醫學雜志，2006；21(3)：207-12.

10Lee JS，Kim HS，Park JT，etal.Expression of vascular endothelial growth factor in the progression of cervical neopla-sia and its relation to angiogenesis and p53 status〔J〕.Anal Quant Cytol Histol，2003；25(6)：303-11.

11Granblatt MS,Benett WP,Hollstein M,etal.Mutation in the p53 tumor suppressor gene;clues to cancer etology and molecular pathogenesis〔J〕. Cancer Res,1994；54(12):4855-78.

12Laderoute KR，Alarcon RM，Brody MD，etal.Opposing effects of hypoxia on expression of the angiogenic inhibitor thrombospondin 1 and the angiogenic inducer vascular endothelial growth factor〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(7):2941-50.

13Linderholm B，Hindh B，Tavelin B，etal.p53 and vascular-endothelial-growth factor(VEGF) expression predicts outcome in 833 patients with primary breast carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2000；89(1)：51-62.

14Sawan A,Lason I,Veron M,etal.NDPK/nm23 expression in human breast cancer in relation to relapse,survival and other prognostic factor.An immunohistochemical study〔J〕.J Pathol，1994；172:72.