不同數量骨髓間充質干細胞靜脈移植治療老年糖尿病大鼠的療效

劉雅娟 郭 麗 張桂英 孫 擎 邵夢楠

(吉林大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，吉林 長春 130021)

1型糖尿病是由T細胞介導的自身免疫性疾病，以胰島β細胞的破壞為特征，每日注射胰島素可以緩解病情；β細胞移植也是一種治療方法，但是存在供體不足和免疫排斥的問題〔1〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)免疫原性弱，靜脈移植后可以定位在受損部位并分化成該部位的細胞修復損傷。以往發現體外誘導BMSCs分化成胰島樣細胞，移植到糖尿病模型大鼠腎被膜下可以治療糖尿病〔2〕。也有研究者發現BMSCs不分化成胰島樣細胞，直接靜脈移植也可以治療糖尿病〔3,4〕，但是靜脈移植多少細胞能有效治療糖尿病報道較少。本文擬探討不同數量的BMSCs靜脈移植進老年糖尿病大鼠體內對糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar大鼠；胎牛血清、DMEM培養液 (美國Gibco公司)、帕可爾(Percoll)分離液、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、鏈脲佐菌素(STZ )(美國Sigma公司)；人白細胞抗原-B27、胎牛血清、活化素、胰島素、地塞米松(國產)。

1.2胰腺條件培養液制備 20只周齡Wistar大鼠，處死，無菌條件下取胰腺組織，勻漿器研磨，離心取上清，-70℃反復凍融，1 500 r/min離心10 min，去上清凍存備用。

1.3大鼠BMSCs、分離、擴增培養與鑒定 采用本實驗室常規培養、擴增法〔5〕。將周齡大鼠脫臼處死，消毒、無菌條件下取股骨，用DMEM(低糖)培養液反復沖洗髓腔，制備單細胞。加等體積的Percoll分離液，2 000 r/min離心20 min，收集細胞的界面層，分離的骨髓有核細胞按1×106/ml的密度接種于25 cm2的塑料培養瓶中，將細胞置于5%CO2，飽和濕度的37℃孵箱中培養。培養48～72 h后，通過換液去除懸浮的細胞，添加完全培養液繼續培養。以后每3～4 d換液一次，待細胞生長至80%～90%匯合后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDAT消化細胞，傳代。采用FACScan流式細胞儀(美國BD公司)直接熒光法，檢測細胞表而標志，鑒定BMSCs。

1.4體外誘導BMSCs向胰島樣細胞轉化與鑒定 取第3代BMSCs胰酶消化，制成單細胞，按2×105/ml分成3個實驗組和1個對照組，接種于6孔板中，使用無血清低糖培養基培養2～3 d。實驗組分別加bFGF、EGF、人白細胞抗原-B27添加劑、誘導培養6～7 d；然后換用無血清高糖培養基，添加胰腺條件培養液肝細胞生長因子(HGF，10 μg/ml)2%人白細胞抗原-B27，活化素A(Active A)、巰基乙醇及尼克酰胺，繼續培養6～7 d；對照組不加任何因子。雙硫蹤染色鑒定胰島樣細胞團，將誘導的細胞用緩沖液沖洗后，加雙硫蹤液，37℃孵箱孵育0 min，倒置顯微鏡觀察細胞，透射電鏡觀察細胞超微結構。

1.5大鼠糖尿病模型制作 雄性老年Wistar大鼠60只(9月齡)，體重(380±40)g，清潔級，購自吉林大學實驗動物中心，苦味酸標記動物。其中正常對照組10只，另外50只進行糖尿病造模處理。按60 mg/kg體重尾靜脈1次注射1%STZ溶液，48 h后用血糖儀(強生公司，穩豪型)檢測大鼠尾靜脈血糖，>13.6 mmol/L、穩定5 d為成功模型，共有44只成模。將糖尿病大鼠分成4組：模型組、2×104、2×105、2×106細胞移植組，每組11只。細胞移植組經球后靜脈分別注入2×104、2×105、2×106個BMSCs于糖尿病大鼠體內，分兩次間隔24 h移植細胞。移植10 d后，分別檢測模型鼠的尿糖、血糖，觀察其治療效果。

1.6統計學分析 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1BMSCs培養 經Percoll分離液分離、細胞種植24 h后，少量梭形細胞貼壁, 72 h后貼壁細胞增多,呈圓形、橢圓形、梭形等。細胞80%融合后用0.25%胰酶消化傳代后，貼壁細胞大多呈梭形。流式細胞儀鑒定所得細胞表達CD44、不表達 CD34，表明所得細胞是骨髓中一群處于未分化狀態的非造血細胞的幼稚干細胞。

2.2誘導BMSCs分化成胰島樣細胞 加入誘導劑后，BMSCs形態逐漸發生變化，由長梭形變成圓形。誘導1 w后，圓形細胞增多，并聚集成團；2 w 后，部分細胞團呈懸浮狀。透射電子顯微鏡下觀察誘導分化的BMSCs,有類似胰島細胞的結構，細胞質內有大量的圓形分泌顆粒，線粒體、粗面內質網和高爾基復合體較多。雙硫蹤染色呈亮紅色，鑒定為胰島樣細胞團。

2.3糖尿病模型大鼠鑒定 腹腔內注射STZ溶液3 d后，大鼠出現多飲、多食癥狀;1 w后,多數大鼠出現多飲、多尿、多食癥狀。結果顯示,注射STZ前大鼠血糖值為(5.75±0.64)mmol/L，尿糖值為(2.87±0.85) g/L；注射STZ1 w后分別為(22.35±2.13)mmol/L, (21.23±1.61) g/L。模型動物血糖、尿糖值明顯增高，與注射STZ前比較差異顯著(P<0.05)。

2.4不同數量BMSCs移植后對糖尿病大鼠血糖、尿糖的抑制作用 當移植細胞量為2×106個BMSCs時，尿糖和血糖值顯著下降，顯著低于模型組(P<0.01)，見表1。

表1 不同細胞數量BMSCs移植對糖尿病大鼠血糖和尿糖的影響±s)

3 討 論

目前關于糖尿病的治療主要關注三點：預防剩余β細胞的破壞，β細胞的恢復以及對β細胞的免疫保護〔6〕。1型糖尿病的治療方法都不夠理想，BMSCs完全可以滿足上述要求。已有研究表明BMSCs能通過增強胰島的再血管化增強移植胰島的存活和功能〔7,8〕。本研究發現，BMSCs可以被分階段誘導為胰島樣細胞。許多研究也證明BMSCs可以體外誘導分化成胰島樣細胞〔9〕。我們以往將骨髓間充質干細胞分化的胰島樣細胞可以治療糖尿病，但是誘導試劑較多，成本較大。直接進行BMSCs靜脈移植可以減少成本，但是關于移植的最適合數量報道較少，本實驗結果表明2×106的療效最好，能夠有效降低血糖和尿糖。

4 參考文獻

1Figliuzzi M, Bonandrini B, Silvani S,etal. Mesenchymal stem cells help pancreatic islet transplantation to control type 1 diabetes〔J〕.World J Stem Cells,2014;6(2):163-72.

2楊柏梁,郭 麗,任淑萍, 等. 骨髓間充質干細胞對糖尿病大鼠療效觀察〔J〕.中國公共衛生, 2009；25(8):973-4.

3Gao X, Song L, Shen K,etal.Bone marrow mesenchymal stem cells promote the repair of islets from diabetic mice through paracrine actions〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2014;388(1): 41-50.

4Hu J, Wang Y, Wang F,etal. Effect and mechanisms of human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells on type 1 diabetes in NOD model〔J〕. Endocrine,2014;30(1):1-11.

5劉雅娟,李秀東,陳 強,等.骨髓間充質干細胞體外誘導分化為胰島樣細胞及其對壞死胰腺組織的修復〔J〕.吉林大學學報(醫學版),2005;31(6):836-8.

6Chhabra P, Brayman KL. Stem cell therapy to cure type 1 diabetes: from hype to hope〔J〕.Stem Cells Transl Med,2013;2(5):328-36.

7Ito T, Itakura S, Todorov I,etal.Mesenchymal stem cell and islet co-transplantation promotes graft revascularization and function〔J〕.Transplantation,2010;89(12):1438-45.

8Figliuzzi M, Bonandrini B, Silvani S,etal. Mesenchymal stem cells help pancreatic islet transplantation to control type 1 diabetes〔J〕.World J Stem Cells,2014;6(2):163-72.

9Jafarian A, Taghikhani M, Abroun S,etal.Generation of high-yield insulin producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Mol Biol Rep,2014;33(1):1-12.