高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞中embelin對VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用

孫雅彬 宋 鄂 郝繼龍 葉 飛 張 泳 徐越超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林 長春 130021)

眼內(nèi)新生血管生成是糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)病情發(fā)展的重要標(biāo)志〔1〕。血管內(nèi)皮生長(VEGF)及其受體在血管新生、血管分化及增加血管通透性等方面起重要作用〔2，3〕。然而，在 DR眼內(nèi)新生血管生成中，調(diào)控VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)的確切機(jī)制尚不清楚。在高糖情況下，Müller細(xì)胞在病理性眼內(nèi)新生血管生成中起到至關(guān)重要的作用〔4〕。應(yīng)用XIAP抑制劑embelin研究高糖情況下XIAP對VEGF表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1化學(xué)藥品 Embelin (Sigma公司，美國)，貯存原液濃度為50 mmol/L，溶解于DMSO (Sigma公司，美國)中，儲存于-20℃?zhèn)溆谩mblin原液用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為0～60 μmol/L。無血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司，美國Fair Lawn))至終濃度為5，10，25,50 mmol/L。

1.2Müller 細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)〔1〕的方法，分離并培養(yǎng)Sprague-Dawley (SD) 大鼠的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞。SD大鼠處死后立即摘除眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體等非視網(wǎng)膜組織后，將視網(wǎng)膜切成 1 mm×1 mm大小的組織塊，以30 μm 尼龍篩過濾后加入0.25% 胰蛋白酶，37℃孵育30 min。收集濾過物，500 r/min離心5 min。Müller 種植于 6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清的DMEM(100 μg/ml 鏈霉素，100 U/ml青霉素)，在 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。 24 h后更換培養(yǎng)液，卻掉未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞，Müller細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)生長，每3日更換一次培養(yǎng)液。以0.25%的胰蛋白酶和EDTA 37℃消化并分離貼壁的Müller細(xì)胞，第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Müller細(xì)胞的鑒定是透射電鏡下見到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特異性的中間絲結(jié)構(gòu)。

1.3Western印跡分析 Müller細(xì)胞在不同葡萄糖濃度(5，10，25，50 mmol/L)和(或)emblin(0，15，30,60 μmol/L)的培養(yǎng)液中孵育72 h后，冷PBS清洗2次。提取總蛋白，每孔20 μg 蛋白質(zhì)樣本10% SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至尼龍膜上。膜與一抗共孵育，包括XIAP(1∶250，BD Biosciences公司，美國San Jose)和VEGF (1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology公司，美國)，4℃過夜。膜與結(jié)合了辣根過氧化物酶(Amersham，美國Arlington Heights)的抗兔抗體中孵育，化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)，并且化學(xué)發(fā)光信號由ChemiDoc XRS 系統(tǒng) (Bio-Rad公司，美國 Hercules)拍攝成像。同一張膜再用單克隆抗β-actin抗體(1∶10 000，美國Sigma公司)阻斷。 每種蛋白質(zhì)的信號由densitometric scanning (Quantity One software package，美國Bio-Rad公司)檢測。

2 結(jié) 果

與正常葡萄糖濃度組相比，VEGF和XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)與葡萄糖濃度呈濃度依賴性，25 mmol/L葡萄糖組這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)增加2倍，50 mmol/L葡萄糖組增加超過3倍(圖1A)。高糖(50 mmol/L)條件的 Müller 細(xì)胞與不同濃度(15，30，60 μmol/L)的embelin共同培養(yǎng)72 h，進(jìn)一步證實(shí)VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)與XIAP的關(guān)系。結(jié)果顯示，embelin使XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)下降，從而導(dǎo)致 VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)下降(圖1B)。

A：Western印跡分析顯示，Müller細(xì)胞在不同葡萄糖濃度中培養(yǎng)72 h，隨著葡萄糖濃度的增加，XIAP和VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸增加；B：embelin抑制了 Müller細(xì)胞中XIAP和VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)，這種抑制作用呈劑量依賴性

3 討 論

Müller細(xì)胞在DR的病理過程中起到非常重要的作用。在糖尿病患者眼內(nèi)Müller細(xì)胞作用表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞數(shù)量增多。這種增殖作用是Müller細(xì)胞中幾條重要的信號傳導(dǎo)通路共同參與的結(jié)果，包括 XIAP/凋亡信號通路、VEGF 信號通路和細(xì)胞循環(huán)調(diào)控通路等。這些信號傳導(dǎo)通路的變化可以減少M(fèi)üller 凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。并且，XIAP可能是這些信號通路的中心調(diào)控因子，將高糖信號傳遞到細(xì)胞周期中，促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，應(yīng)用XIAP的抑制劑embelin可以使高糖引起的信號通路的改變重新恢復(fù)到正常水平，抑制細(xì)胞增殖。

VEGF是一種最重要的促進(jìn)新生血管生成和增加血管通透性的因子〔3〕。在視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞是VEGF產(chǎn)生的主要來源，尤其是在高血糖的情況下。本文研究證實(shí)，高糖可以刺激Müller細(xì)胞中VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)增加，提示高糖對于Müller 細(xì)胞中VEGF表達(dá)具有調(diào)控作用。

在本文中，高糖條件下，XIAP的表達(dá)強(qiáng)有力地調(diào)控了VEGF的表達(dá)，并且XIAP的抑制劑embelin使VEGF表達(dá)下調(diào)，提示XIAP在高糖誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)中起著調(diào)控作用。XIAP是凋亡抑制因子(IAP)家族中的一員，是細(xì)胞凋亡的內(nèi)在調(diào)控因子。近期研究證實(shí)，IAPs不僅調(diào)控半胱天冬酶和凋亡，而且調(diào)節(jié)炎癥通路、免疫通路、有絲分裂酶通路、增殖通路和有絲分裂通路〔5〕。例如，近期報道顯示，XIAP 通過它的RING指結(jié)構(gòu)調(diào)控泛素(ubiquitin，Ub)依賴性IκB 酶(IKK)激活，IκB 酶可以激活NFκB〔6〕。通過經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路，NFκB調(diào)控下游基因uPA〔5〕，IL-1β〔7〕，CREB和TNF-α〔8～10〕的表達(dá)，這些蛋白質(zhì)可以增加VEGF的表達(dá)〔10,11〕。

因?yàn)閄IAP在高糖誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，因此XIAP將成為DR治療的潛在靶點(diǎn)。embelin是植物 embelia ribes的提取物，是一種細(xì)胞通透性小分子XIAP抑制劑〔12〕。embelin具有抗腫瘤，抗炎以及止痛等作用。本研究顯示，在Müller細(xì)胞中embelin可以抵消高糖誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)，提示embelin具有治療DR的作用。

綜上，XIAP是高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞病理改變的中心調(diào)控因子，而embelin是XIAP的選擇性抑制劑，有預(yù)防和治療DR的作用。

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