基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗對CD8+T 細胞的免疫抑制效應

石雁冰 郉立志 李樹法 張媛媛 張蘭舉 馬桂潔 姜春艷

(貴陽中醫學院第一附屬醫院門診部，貴州 貴陽 550002)

目前1型糖尿病(T1DM)以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，其費用高昂且副作用大，亟需尋找一種特異性免疫干預策略〔1～4〕。研究表明，誘導自身反應性CD8+T細胞的免疫耐受是一種有效的T1DM治療策略，可減緩甚至完全阻斷T1DM的發生和發展〔5,6〕。B、T淋巴細胞弱化因子(BTLA)為近年發現的負性共刺激分子，抑制或下調T細胞的活化和細胞因子的產生，參與多種免疫性疾病的發生、發展〔7,8〕。ZnT8又稱SLC30A8，介導鋅離子從胞漿至囊泡的轉運，參與胰島素的合成、儲存和分泌的調節。ZnT8也可作為自身抗原引起T細胞介導的以β細胞受損為特征的自身免疫反應，甚至誘發T1DM〔9〕。在本實驗中，制備基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并觀察對CD8+T 細胞的抑制效應。

1 材料與方法

1.1融合肽 為RKKRRQRRRLLIDLTSFL，委托中科亞光合成。其中N末段RKKRRQRRR為含有正電荷的陽離子穿膜肽HIV-Tat49-57 , C末段LLIDLTSFL為ZnT8的人白細胞抗原(HLA2)-A2.1限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位。BTLA表達質粒和對照空白質粒由本實驗室構建。CD8+T細胞分離試劑盒購自Miltenyi 公司。ELISPOT檢測干擾素(IFN-γ)試劑盒購于法國DIACLONE公司。其他為常用試劑。

1.2疫苗的制備 在特定的NaCl濃度下將100 μg/ml的100 μl陽離子肽溶液逐滴滴入100 μl混旋狀態含有500 μg/ml DNA的水溶液中，5 μl/min，從而制備疫苗。滴定完畢后制備產物繼續混旋30 min，靜置30 min。

1.3體外免疫 HLA2-A2.1 陽性的健康人外周血濃縮白細胞經常規聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離，獲得外周血單個核細胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基調節細胞為1×106/ml。分別用肽終濃度為10 μmol/L 的含有表達質粒BTLA的疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽， 空白質粒疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，磷酸鹽緩沖液(PBS)+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，反復刺激PBMC，每7 d 刺激1 次，刺激3次后第3天，收集PBMC，作為效應細胞進行ELISPOT檢測和標準51 Cr釋放實驗。

1.4免疫磁珠分選( MACS) 純化CD8+T細胞 取4×107細胞，1 200 r/min 離心10 min，去上清液后用160 μl 緩沖液重懸，加40 μl 抗體Cocktail 充分混勻，4℃孵育10 min。加160 μl緩沖液，1 200 r /min離心10 min，去上清液，再加入320 μl 緩沖液、80 μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r/min離心10 min。吸除上清液，用500 μl 緩沖液重懸細胞， 200目篩網過濾成無氣泡的單細胞懸液。將MS細胞分離柱置于MACS 磁力架上，先用500 μl 緩沖液洗柱，再將細胞懸液通過MS 柱，1 500 μl 緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細胞，計數。

1.5ELISPOT檢測 參照ELISPOT(IFN-γ)試劑盒使用說明書進行檢測。調整細胞為1×106個/ml，于96孔培養板中每孔加入100 μl細胞懸液，各設3個復孔，孵育時間為48 h。陰性對照不加細胞孵育，計數各孔出現的色斑數目。

1.6淋巴細胞增殖能力檢測 調整細胞為1×106個/ml，于96孔培養板中每孔加入100 μl細胞懸液，加入終濃度為100 μg/ml的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)，培養72 h。每孔再加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 溶液，繼續培養12 h，用PBS漂洗細胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預冷的體積分數為5% 的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，轉移入閃爍瓶中，加入5 ml 閃爍液，用液體閃爍計數器計數每分鐘的閃爍次數(cpm)，測定DPM值(反映細胞DNA 合成速率)，重復測定3 次。

1.7靶細胞的制備與標記 10 mg/L的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)與1×106個/ml的T2細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養6 h后作為靶細胞。采用標準的51Cr釋放實驗,于V型板各孔中加入標記的靶細胞1×104/孔。各靶細胞孔中加入不同稀釋度的效應細胞, 使相應的效靶比分別為25∶1、50∶1和100∶1，每組設立3個復孔。最大殺傷采用2 mol/L的HCl，自釋放為靶細胞加培養基。于37℃、50 ml/L CO2孵育4 h，以1 000 r/min 離心10 min，各取上清液100 μl，用γ計數器分別測定液體閃爍計數值(cpm值)，計算51Cr特異釋放率。51Cr特異釋放率=(實驗組cpm平均值-自釋放cpm平均值)/(最大釋放cpm平均值-自釋放cpm平均值)×100%

1.8統計學處理 采用SPSS10.0軟件和t檢驗對數據差異進行分析。

2 結 果

2.1ELISPOT檢測結果 用ELISPOT檢測CD8+T細胞的IFN-γ分泌情況。BTLA組CD8+T細胞的IFN-γ分泌數量為(46±7)個，而空白質粒組和PBS對照組的IFN-γ分泌數量為(97±16)個和(104±19)個。實驗證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細胞的活化。

2.2淋巴細胞增殖結果 用3H-TdR檢測CD8+T細胞的增殖情況。BTLA組CD8+T細胞的cpm值為(37 000±3 100)，而空白質粒組和PBS對照組的cpm值為(51 000±6 100)和(53 000±6 400)。實驗證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細胞的增殖。

2.3Cr釋放分析 進一步采用51 Cr釋放分析各組誘導的CD8+T細胞反應對靶細胞的殺傷情況。BTLA組誘導CD8+T細胞的殺傷率均明顯低于空白質粒組和PBS對照組。實驗證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細胞的對靶細胞的殺傷。見圖1。

圖1 各實驗組對靶細胞的殺傷率

3 討 論

目前普遍認為T1DM是在遺傳和環境因素共同作用下，由T淋巴細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病〔10,11〕。主要是由于免疫系統的異常，CD4+和CD8+T淋巴細胞對胰島的浸潤，引發胰島炎癥并導致對胰島β細胞的損傷，使胰島素分泌絕對減少，引起體內胰島素絕對缺乏從而導致血糖持續升高，產生T1DM〔12,13〕。多種免疫機制參與T1DM的發病，為糖尿病的預防提供了途徑和方向。目前研究表明，應用免疫調節藥物和細胞等手段可以抑制胰島炎癥作用，減少β細胞的免疫破壞及凋亡，誘導特異性免疫耐受，從而達到預防及阻止糖尿病發病。

BTLA是2003年發現的CD28家族共抑制受體, 主要表達于T、B細胞, 在DC、單核及自然殺傷(NK)細胞上也有表達, 其結構和功能與CD28家族其他兩種抑制性受體CTLA-4和PD-1相似〔14〕。現已證明BTLA的配體是HVEM, 兩者結合可負性調節T、B細胞的激活與增殖, 維持樹突細胞在內環境中的穩定, 抑制記憶性CD8+T細胞的分化, 調節機體固有免疫系統早期抗感染的過程等作用〔15〕。ZnT8 是專一性的鋅轉運體家族-ZnT 家族的成員之一。ZnT8 是自身免疫性T1DM的主要自身抗原之一，其敏感性及特異性與IA2A、GADA、IAA 這三個被認為是“金標準”的抗原相似〔16〕。ZnT8 在胰島功能調節中的作用使其有望成為糖尿病治療的新靶點。

因此，理論上基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗有可能抑制抗原特異性的CD8+T淋巴細胞免疫應答。在本實驗中，制備了基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并觀察其對CD8+T細胞的免疫抑制效應。實驗在體外免疫人外周血單個核細胞，檢測對CD8+T細胞增殖和活化情況。實驗結果提示該疫苗能有效抑制人外周血單個核細胞的CD8+T細胞增殖，細胞因子分泌和對靶細胞的殺傷能力。

綜上所述，基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗對CD8+T細胞具有免疫抑制效應，為T1DM的治療提供了理論基礎。

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