四妙勇安湯對H2O2致內皮細胞ECV304損傷的保護作用

李 娜 曲曉波 葉豆丹 李 晶 律廣富 林 賀 楊 擎 常志達 張靖卓 李 斌 林 喆

(長春中醫藥大學研發中心藥理實驗室，吉林 長春 130117)

四妙勇安激發(SMYA)是治療熱毒性脫疽的經驗良方，由金銀花、玄參、當歸、甘草四味藥組成，具有清熱解毒、滋陰活血、通絡功效。熱毒性脫疽是古時候的主要適應證，和現代醫學中的多種動脈狹窄或閉塞而導致的趾(指)脫落壞死性疾病相似，包括血栓閉塞性脈管炎、動脈硬化閉塞癥、糖尿病性壞疽等疾病〔1～3〕。本研究通過對SMYA對氧化損傷內皮細胞保護作用的研究，為進一步探討其作用機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1細胞系 人臍靜脈內皮細胞株ECV304(長春中醫藥大學研發中心)，用含10%胎牛血清1640培養基于37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。

1.2藥物、試劑與儀器 SMYA醇提物，由長春中醫藥大學研發中心實驗室制備；血管緊張素轉化酶(ACE)、內皮素(ET)、內皮型一氧化氮合酶(eNOs)酶聯免疫檢測試劑盒為美國BG公司產品；流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司。

1.3方法

1.3.1分組 取對數生長期的內皮細胞ECV304隨機分成三組：空白組，用正常培養液培養；模型組，H2O2損傷，濃度為1 mmol/L，損傷4 h；SMYA組：先用H2O2損傷4 h后，50%EtOH提取物100 μg/ml培養24 h。

1.3.2四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞活力 消化后的細胞，5×104個/ml，200 μl接種于96孔板，培養24 h完全貼壁，按1.3.1分組，模型組和SMYA組先用H2O2(1 mmol/L，4 h)處理，棄上清，模型組用正常培養基培養，給藥組用SMYA醇提物處理24 h，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)使其顯色，顯色后振動孵育10 min，使結晶溶解完全，酶標儀490 nm測吸光度值(OD值)。

1.3.3SMYA醇提物對氧化損傷ECV304細胞周期的影響 取對數生長期的各組細胞，胰酶消化后收集細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。將約1 ml，4℃70%乙醇緩緩貼壁加入離心管，固定細胞。上機前，1 500 r/min離心5 min，重新收集細胞，PBS洗2次。加入RNA酶和20 μl溴化碘(PI)，室溫避光染色20 min，用300目尼龍網過濾，經流式細胞儀檢測。

1.3.4SMYA醇提物對氧化損傷ECV304細胞凋亡率的影響 取對數生長期的各組細胞，胰酶消化后收集細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃PBS清洗兩次。先加500 μl Binding Buffer，然后分別將5 μl Annexin V-FITC和PI 10 μl加入，避光孵育10 min，1 h內上機檢測。

1.3.5ACE、ET、eNOs含量測定 按1.3.1方法培養細胞后，收集細胞培養液，10 000 r/min，離心10 min，取上清液，按試劑盒要求，檢測細胞上清液中ACE、ET、eNOs的含量。

1.4統計學處理 計量資料組間比較行t檢驗。

2 結 果

2.1SMYA醇提物對H2O2損傷ECV304細胞活力的影響 模型組細胞活力(0.76±0.07)明顯低于空白組(1.30±0.19)(P<0.01)，說明模型建立成功；且SMYA組細胞活力(1.34±0.10)均高于模型組(P<0.01)。

2.2SMYA醇提物對H2O2損傷ECV304細胞凋亡的影響 結果顯示，空白組細胞凋亡率為9.5%，模型組為23.3%，而SMYA醇提物處理過的損傷后ECV304的凋亡率為13.2%，模型組細胞凋亡率最高，SMYA醇提物干預后細胞凋亡率明顯降低。

2.3SMYA醇提物對H2O2損傷ECV304細胞周期的影響 由檢測結果分析，模型組與空白組比較，G1期細胞比例增多(P<0.01)，進入S和G2期的細胞百分比減少(P<0.05)，與模型組比較SMYA組，G1期細胞進入S和G2期的細胞百分比增多，G1期細胞百分比顯著下降(P<0.05)，S期細胞百分比顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 SMYA醇提物對H2O2損傷的ECV304細胞周期的影響±s,n=6，%)

2.4SMYA醇提物對H2O2損傷ECV304細胞中ACE、ET、eNOs影響 模型組H2O2可使ACE和ET的含量明顯增高，eNOS活性降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，SMYA醇提物可抑制ACE的活性，并可顯著性降低ET含量(P<0.05)，升高eNOS活性(P<0.01)。見表2。

表2 SMYA50%醇提物對H2O2氧化損傷ECV304分泌ACE、ET、eNOS的影響±s,n=6)

3 討 論

SMYA在古代是治療熱毒性脫疽的經驗良方，具有清熱解毒、滋陰養血、活血化瘀等功效，現代醫學多用于治療周圍血管性疾病，前期工作中，建立了血栓閉塞性脈管炎模型大鼠，觀察SMYA對其血脂、血液流變學及抗炎的作用，證明了SMYA對血栓閉塞性脈管炎大鼠的治療作用〔4,5〕。為進一步探討其機制，從細胞水平進行了研究。

血管內皮細胞(VEC)是覆蓋于血管內膜表面的單層扁平或多角形的細胞，形成血管的內壁，與平滑肌細胞和間質細胞等共同構成完整的血管壁〔6,7〕。VEC的功能和血管活性物質，如血管內皮生長因子、內皮素(ET)、一氧化氮(NO)和血管緊張素(ACE)Ⅱ等物質有著密切的聯系。VEC受損在多種疾病的發病機制中起到重要作用，例如血栓閉塞性脈管炎。缺氧條件下，可以使內皮細胞功能明顯損傷，可探討血管功能變化與調控機制〔8～10〕。ACE催化血管緊張素(Ang)Ⅰ轉化為(Ang)Ⅱ，使緩激肽失活。AngⅡ可導致血壓上升，強烈的收縮外周小動脈，促進醛固酮的合成和分泌；重吸收鈉離子和水，增加血容量；AngⅡ是最強的升壓活性物質。研究表明，SMYA 50%醇提物能夠明顯抑制過氧化氫損傷ECV 304分泌ACE，阻斷了腎素血管緊張素系統的進一步發展。如吳旭等〔11〕認為VEC、ACE在缺血缺氧時表達增多〔12,13〕。

ET和NO是一對相互拮抗的物質，正常生理情況下，兩者相互作用，形成穩定的血管內皮調節系統，ET可增加NOS的活性，從而促進NO的生成，而NO又可以反過來拮抗ET的作用。兩者之間的這種拮抗作用在維持血管正常收縮與舒張功能和調節局部血流等方面起到重要的作用〔14〕。

G1期又稱為合成前期，處于這一期的細胞物質代謝活躍，細胞體積大，為S期DNA復制作物質和能量的準備。S期是DNA合成期，合成組蛋白。G2期是DNA合成后期，是有絲分裂的準備期，DNA合成終止。M期為細胞分裂期。G1期和S期階段細胞分布的多少，是評價細胞狀態和細胞環境的關鍵。本實驗表明，SMYA醇提物可明顯促進H2O2損傷ECV304G1期細胞增殖，減少細胞凋亡。本實驗通過檢測正常內皮細胞、缺氧條件下內皮細胞及SMYA干預缺氧內皮細胞三種細胞的細胞周期，表明SMYA醇提物具有明顯降低氧化損傷細胞凋亡率的能力，促進細胞增殖。

本實驗建立了內皮細胞缺氧模型，通過檢測細胞活性，細胞周期與凋亡，以及內皮細胞分泌ACE、ET和eNOS含量，證明了SMYA醇提物具有明顯的保護氧化損傷內皮細胞的作用，為進一步的研究提供了依據。

4 參考文獻

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