苦蕎麥總黃酮對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

柳 春 楊雪峰 張瑞鵬 趙丹玉 王艷杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

血管并發(fā)癥是致2型糖尿病患者死亡的主要原因，而高頻率的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管病變發(fā)生的第一步〔1〕。苦蕎麥總黃酮主要存在于苦蕎麥花、葉、莖、籽粒中，具有抗氧化、抗衰老、改善血管微循環(huán)的作用〔2〕。軟脂酸(PA)可致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過觀察苦蕎麥總黃酮對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926)凋亡模型的影響，探討其抑制細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，體外培養(yǎng)傳代。DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；PA、二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；RT-PCR 試劑盒、Trizol、瓊脂糖購(gòu)自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2抗體、羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基置于37℃，5% 二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng),每2～3天換液，細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合后,用0.25%胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)用第3～4代細(xì)胞。細(xì)胞分為對(duì)照組(50 ng/L胰島素),模型組(50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA)，苦蕎麥總黃酮組(50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA+125 μg/ml)和二甲雙胍組 (50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA+2 mmol/L二甲雙胍) 。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2 mRNA表達(dá) Trizol法提取總RNA并測(cè)定其含量。RT-PCR法對(duì)Bcl-2進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin 為內(nèi)參。人β-actin 引物:上游引物：AggAgC AATgATCTTgATCTTCA-3′，下游引物:5′-ATCATgAAgTgTACgTggACAT-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度153 bp)。Bcl-2引物：上游引物：5′-TgggAgAACAgggTACgATA-3′，下游引物： 5′-CCACCgAACTCAAAgAAgg-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度453 bp)。Bcl-2 退火溫度為56℃，β-actin 的退火溫度為65℃。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用Bcl-2 條帶光密度值與內(nèi)參β-actin條帶光密度值的比值表示。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2 蛋白表達(dá) 采用免疫組化SABC法測(cè)定EA.hy926細(xì)胞Bcl-2 蛋白的表達(dá)。各組細(xì)胞處理后用多聚甲醛固定,PBS沖洗3遍，加0.5%的TritonX100 20 min,再次用PBS沖洗3遍，加0.3% 過氧化氫(H2O2)15 min。5%BSA封閉20 min，滴加兔抗人Bcl-2 抗體4℃過夜。用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃ 20 min。PBS沖洗3遍，DAB法顯色。陰性對(duì)照：一抗用PBS代替，其余條件相同。

2 結(jié) 果

2.1苦蕎麥總黃酮對(duì)PA刺激后EA.hy926 細(xì)胞Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響 模型組中Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低,與對(duì)照組有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，苦蕎麥總黃酮組與苦蕎麥總黃酮組Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.05)。苦蕎麥總黃酮組與二甲雙胍組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2苦蕎麥總黃酮對(duì)PA刺激后EA.hy926 免疫組化結(jié)果表明，對(duì)照組可見大量Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,且呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；模型組偶見Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,陽(yáng)性程度較弱；苦蕎麥總黃酮組和二甲雙胍組可見大量Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，陽(yáng)性程度與模型組相比顯著增加。見表1。

表1 苦蕎麥總黃酮對(duì)PA刺激后EA.hy926細(xì)胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響±s,n=6)

3 討 論

血漿游離脂肪酸(FFA)濃度增高是糖尿病血管病變的重要危險(xiǎn)因素，而PA是FFA 的主要成分。已證實(shí)，高濃度PA 可導(dǎo)致胰島素抵抗，導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔3，4〕。細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞主動(dòng)的、由基因調(diào)控的死亡過程〔5〕。Bcl-2 家族在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程中起著至關(guān)重要的作用。此家族包括兩類功能相反的蛋白,促凋亡成員如Bax、Bad 等，抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-xl 等。Bcl-2 是一種原癌基因，通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。所以，Bcl-2 表達(dá)下調(diào),則抗凋亡能力下降,細(xì)胞凋亡增加〔6〕。而內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡則促使血栓形成〔7〕，影響血管重構(gòu)，從而誘發(fā)糖尿病血管病變。因此,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度凋亡是防治糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵。但目前臨床尚缺乏有效藥物。

苦蕎麥味苦，性平、寒，有悠久的入藥歷史。《本草綱目》：“降氣寬腸磨積滯 ，消熱腫風(fēng)痛。”流行病學(xué)研究結(jié)果表明：苦蕎麥具有降血糖、降血脂和降血壓的作用〔8〕。苦蕎麥總黃酮是苦蕎麥主要化學(xué)成分，具有軟化血管、降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)、防止血細(xì)胞凝集等作用〔9〕，主要包括蘆丁、槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-雙鼠李糖苷等〔10〕。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察苦蕎麥總黃酮對(duì)PA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)苦蕎麥總黃酮可明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，抑制PA所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)以RT-PCR 技術(shù)和免疫組化法檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，同對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Bcl-2 基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明PA可降低Bcl-2 基因的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；苦蕎麥總黃酮組和二甲雙胍組細(xì)胞同模型組相比，EA.hy926 細(xì)胞Bcl-2 mRNA及蛋白明顯升高，說明苦蕎麥總黃酮及二甲雙胍可促進(jìn)Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡,提升EA.hy926細(xì)胞的增殖能力。苦蕎麥總黃酮組與二甲雙胍組相比，Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)無明顯差異，作用相當(dāng)。但是二甲雙胍毒副作用較強(qiáng)，不適于長(zhǎng)期使用。

本研究證實(shí)，苦蕎麥總黃酮能促進(jìn)Bcl-2 基因的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此，苦蕎麥總黃酮有利于血管內(nèi)皮的修復(fù)及新生血管的形成，對(duì)2型糖尿病血管并發(fā)癥的防治有十分重要的意義。

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