半固體凝膠介質誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化

張明惠 杜新平 姜忠敏 李艷霞 盛 鳳 劉曉智

(天津市第五中心醫院心內科，天津 300450)

干細胞憑借其多組織分化潛能，成為當前醫學界多學科研究熱點〔1～3〕。各學科在積極嘗試將干細胞誘導分化為各自所需的組織與器官時，由于常帶有明確的目的性和方向性，誘導方法的選擇和實施差別較大，較難比較干細胞在同一干預條件下的橫向分化潛能和特征〔4〕。最近有學者報道將干細胞移植到特定物理密度的材料表面時，干細胞有順材質硬度分化的特性〔5〕。基于此，本研究借助低熔點瓊脂設計出一種低密度介質，研究臍帶間充質干細胞在該介質中的生長狀態和組織分化特點，嘗試利用物理干預手段實現干細胞向心肌組織的橫向分化，為未來心肌組織工程研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試劑和動物 胎牛血清(杭州四季青產品)，達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，低熔點瓊脂糖(北京中杉公司)，異硫氰酸熒光素標記流式抗體CD29、CD31、CD44、CD45和CD105(英國Serotec公司)，抗小鼠CD34抗體(美國Santa Cruz公司)，抗小鼠心肌特異性基因肌球蛋白重鏈α(α-MHC)和抗小鼠心臟特異性肌鈣蛋白T(cTnT)抗體(美國Santa Cruz公司)；PCR引物由北京賽百勝公司合成，RT-PCR試劑盒購自美國Qiagen公司。清潔級1周齡雄性SD大鼠5只用于BMSCs原代培養。動物由天津醫科大學實驗動物中心提供，飼養于天津市血液病研究所動物實驗中心。

1.2骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分離、培養 雄性SD大鼠拉頸處死后，置于75%酒精中浸泡消毒5 min。無菌條件下分離雙側股骨和脛骨，剪開長骨兩端骨皮質，露出骨髓腔，用含10% FBS的低糖DMEM培養基反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，接種到10 cm塑料培養皿，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下細胞培養箱中培養。第3天半量換液，之后每隔3 d全量換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況。至10～14 d單層貼壁細胞接近90%匯合時，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2傳代。以后隨細胞擴增均于80%～90%匯合時按1∶2持續體外傳代培養。

1.3BMSCs的表面標記蛋白鑒定 體外培養細胞至第4代，接近90%匯合時，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化；收集細胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清后用PBS重懸細胞沉淀；應用血細胞計數板進行細胞計數，取約1×106個細胞懸于100 μl PBS中；分別加入適量異硫氰酸標記CD29、CD31、CD44、CD45、CD105抗體避光染色30 min，CD34檢測采用間接熒光標記法，細胞與CD34抗體反應30 min后，需再與異硫氰酸標記二抗避光反應30 min。最后用1%多聚甲醛600 μl重懸，流式細胞儀檢測分析。

1.4凝膠介質的配制 預先配制含10%胎牛血清的DMEM，取1.28 g低熔點瓊脂糖加入10 ml上述培養基中，充分混勻至溶解，以后依次二等分稀釋配制成6.4%、3.2%、1.6%、0.8%、0.4%和0.2% 6種物理密度基質，儲存備用。使用前加溫融化至液態再冷卻至37℃～39℃后，與BMSCs混合培養。

1.5不同密度凝膠介質中的細胞培養 在48孔板各孔底預鋪置0.5 ml含0.9%瓊脂糖的DMEM培養基，培養箱內過夜凝固；取第5代BMSCs單細胞懸液1×103個細胞分別與上述6種物理密度基質培養液各0.25 ml混勻，迅速加入48孔板中，置于細胞培養箱中過夜凝固；24 h后每孔各加入50 μl含10%FBS的DMEM培養基。7 d后將6種含細胞的凝膠介質制作6 μm薄層切片，低溫冰箱儲存待測。

1.6RT-PCR方法檢測細胞分化標記基因的mRNA水平 提取6種密度凝膠介質中培養的細胞總RNA，反轉錄酶轉錄后進行PCR循環反應。內參照物β-actin上游引物：5′-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3′，下游引物：5′-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3′，擴增長度為 517 bp；α-MHC上游引物：5′-AGCCTCTGCTACTCCTCTTCCTG-3′，下游引物：5′-CCTTTATGGTACCGTTTCC-3′，擴增長度為345 bp；cTnT上游引物：5′-ATCCTCGGACCTGCACCGC-3′，下游引物：5′-CCTACCTAGGCCTGCC-3′，擴增長度為408 bp。反應條件：94 ℃ 3 min，45個循環，循環內94℃ 30 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s。

1.7細胞免疫熒光方法檢測細胞分化標記蛋白的表達 切片放置4℃冰箱30 min后，以4%多聚甲醛固定，Triton X-100處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡，山羊血清封閉30 min；小心吸去血清，滴加適當稀釋度的抗體工作液(cTnT，1∶500；α-MHC，1∶1 000)，濕盒中4℃過夜；加入FITC或TRATIC熒光標記二抗，hoechst33258復染，PBS和去離子水漂洗后，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1BMSCs鑒定 對第4代BMSCs進行流式細胞術鑒定，結果為CD29(99.58%)、CD44(99.16%)、CD105(99.23%)陽性，CD31(2.33%)、CD34(3.13%)、CD45(4.14%)陰性。其中CD29、CD44、CD105是BMSCs特異表達陽性標記物，CD31是內皮細胞標記物，CD34和CD45是造血干細胞標記物。通過多指標聯合檢測證實培養細胞為BMSCs，符合實驗要求。

2.2RT-PCR結果 cTnT和α-MHC mRNA表達水平隨介質密度變化而變化。隨著介質密度增高，cTnT和α-MHC mRNA表達水平均呈現先增高后下降的趨勢，其中cTnT mRNA表達峰值出現在物理密度為1.6%的培養基質中，而α-MHC的峰值出現在物理密度為3.2%的培養基質中。見圖1、圖2。

圖1 PCR方法檢測cTnT和α-MHC的mRNA表達

圖2 cTnT和α-MHC的mRNA表達曲線圖

2.3細胞免疫熒光結果 BMSCs在不同密度基質中培養時可表達心肌細胞標記蛋白，其中綠色熒光為FITC標記的cTnT陽性信號，紅色熒光為TRATIC標記的α-MHC陽性信號，可見BMSCs在不同密度基質中培養時表達cTnT和α-MHC的總體趨勢與RT-PCR結果一致。見圖3。

圖3 免疫熒光顯示BMSCs在不同密度基質中培養時表達心肌細胞標記蛋白(×200)

3 討 論

心肌梗死是心血管系統的常見病。由于成熟的心肌細胞缺乏再生能力，心肌梗死發生后，梗死區心肌只能通過纖維組織增生，由無收縮功能的瘢痕組織代替，最終導致心功能下降和心力衰竭〔6〕。隨著人類和動物胚胎干細胞成功建系及其體外向心肌細胞誘導分化技術日漸成熟，干細胞為治療心血管疾病提供了新的種子細胞來源和思路〔1～3〕。

最近有研究報道，將BMSCs自然貼附于羥基磷灰石膠原蛋白復合支架表面時干細胞表達的骨組織標記蛋白明顯增加〔5〕。我們推測干細胞培養基質的物理密度可能存在誘導干細胞向特定組織分化的潛能。如果該理論正確，將可實現干細胞在同種介質下向多組織細胞的誘導分化，增加可調控性。本研究首次以一種物理性質獨特的超低膠凝溫度的瓊脂糖為介質，配制成不同物理密度的細胞培養基質，對BMSCs進行誘導分化研究，觀察成體干細胞在物理密度介質中的順材質分化特性。超低膠凝溫度的瓊脂糖是一種獨特的“軟瓊脂糖”，具有超低的膠凝及熔化溫度，適用于雜交瘤克隆及制造軟的高純度凝膠。實驗室中最常被應用于細胞培養、雜交瘤克隆、封裝/包埋細胞等〔7〕。在實體組織中，腦組織彈性模量介于0.1～1 kPa，平滑肌組織彈性模量介于8～17 kPa，筋膜組織彈性模量介于25～40 kPa，骨組織彈性模量介于75～100 kPa〔8〕。利用超低膠凝溫度的瓊脂糖與含10%胎牛血清的DMEM培養基按不同比例混合配制成具有不同彈性模量的培養基質，模擬腦組織-平滑肌組織-筋膜組織-軟骨組織-骨組織介質，研究干細胞在上述密度基質中的細胞分化特征。

根據超低溫膠凝瓊脂糖特征，1.6%瓊脂糖凝膠的凝膠溫度為8℃～20℃，彈性模量約12 kPa；3.2%瓊脂糖凝膠的凝膠溫度為10℃～23℃，彈性模量約18 kPa〔8〕。即當BMSCs培養于1.6%～3.2%瓊脂糖凝膠時，介質彈性模量介于12～18 kPa，符合平滑肌組織彈性模量(8～17 kPa)范圍，此時表達心肌細胞標記蛋白cTnT和α-MHC，但二者出現峰值的區間并不完全相同，其內在機制有待進一步研究。總之，本實驗通過改變培養介質的物理密度，實現了將BMSCs向心肌細胞的誘導分化，為未來成體干細胞向不同組織誘導分化提供新的方式選擇。

4 參考文獻

1賀繼剛，沈振亞，滕小梅，等.小鼠骨髓間充質干細胞亞群在心肌梗死中抗凋亡能力的研究〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(3)：556.

2Morozova VT.Stem cells and their structure-function relationships with the connective tissue〔J〕.Klin Lab Diagn,2008；8(8)：32-6.

3劉曉智，劉振林，姜忠敏，等.不同物理密度介質誘導干細胞表達多種組織細胞標記蛋白〔J〕.中華實驗外科雜志，2012；29(2)：341.

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5迮仁浩，楊述華，李 進，等.血管內皮細胞生長因子基因轉染兔骨髓間充質干細胞結合聚乳酸/羥基磷灰石支架治療兔股骨頭壞死的研究〔J〕.中華實驗外科雜志，2014；31(2)：378-80.

6魏增華，郝懷勇，賀敏敏，等.骨髓間充質干細胞聯合Janus激酶信號轉導及轉錄激活因子通路抑制劑治療大鼠腦缺血再灌注損傷〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(7)：1481-3.

7Boerjan ML，Baarends WM，Ruven HJ.A cytochemical staining procedure for succinate dehydrogenase activity in pre-ovulatory mouse oocytes embedded in low gelling temperature agarose〔J〕.J Histochem Cytochem，1991；39(1)：135-8.

8Herrmann RG，Whitfeld PR，Bottomley W.Construction of a SalI/PstI restriction map of spinach chloroplast DNA using low-gelling-temperature-agarose electrophoresis〔J〕.Gene，1980；8(2)：179-91.