斑蝥酸鈉維生素B6對人喉癌Hep-2細胞增殖的抑制作用

劉學識博杰 張 輝 辛 丁 許承弼 王 托 李文靜 鞠 洋 江 昌

(吉林大學第二醫院，吉林 長春 130041)

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。早期癥狀和體征常不明顯，確診時大部分已屬中、晚期，且由于其生長部位特殊，手術很難徹底切除病灶，必須進行綜合治療。因此，尋求喉癌治療的有效藥物具有十分重要的意義。斑蝥酸鈉系斑蝥主要抗腫瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、腎癌、胃癌、宮頸癌等的治療獲得較為滿意的結果，但用于頭頸腫瘤的治療較少。本研究應用人喉癌細胞(Hep-2)為靶點，觀察不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對Hep-2增殖周期進程及凋亡率的改變。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞及試劑 Hep-2細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、RPMI 1640培養基購于美國Sigma公司，斑蝥酸鈉維生素B6注射液10 ml/支，內含斑蝥酸鈉0.1 mg、維生素B625 mg，貴州柏強制藥有限公司生產，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對數生長期的Hep-2細胞經0.25%胰蛋白酶消化，調細胞數為2×105/ml，接種于96孔塑料培養板內，100 μl/孔，當細胞生長達到80%匯合時，分為0 μg/ml組(對照組)、1 μg/ml組、2.0 μg/ml組、4.0 μg/ml組和8.0 μg/ml組，每個濃度10復孔，置37℃ 5%二氧化碳培養箱內靜止培養24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L。繼續培養6 h后，棄去上清，每孔內加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩5 min，促進MTT還原產物完全溶解，應用酶標儀于570 mm處測定各孔吸光度A值，按下列公式計算Hep-2細胞增殖抑制率，每組實驗重復3次，取平均值，Hep-2細胞抑制率=(1-加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%。對照組A值1.38，1 μg/ml組1.26、2 μg/ml組1.12，4 μg/ml組0.91，8 μg/ml組0.76，1、2、4、8 μg/ml組抑制率分別為15.9%，18.8%，35.1%，45.8%。

1.2.2流式細胞術 細胞培養及分組同1.2.1，不同之處是將96孔培養板改為25 ml培養瓶進行，每個濃度3瓶，培養結束后用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，磷酸鹽緩鹽(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定4℃內保存，上機前過40目網，調細胞數1×106/ml，碘化啞啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，細胞周期結果以Moidff 2.0軟件分析。見表1。

2 結 果

2.1MTT結果 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對Hep-2細胞增殖均有影響，且呈劑量依賴性與對照組相比差異有顯著意義(P<0.05)。見表1。

2.2流式細胞術結果 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對Hep-2細胞周期進程均有影響。G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期相對增多，且細胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對Hep-2細胞周期各時相影響及凋亡率的影響±s,n=3,%)

3 討 論

斑蝥酸鈉維生素B6是一種廣譜的抗癌新藥〔2〕，是斑蝥素的衍生物，它保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小。其抗腫瘤機制：①抑制腫瘤細胞蛋白質的合成，降低腫瘤細胞cAMP的活性；②抑制腫瘤細胞內DNA和RNA及前體的滲入，從而使腫瘤細胞形態和功能發生改變，進而殺滅腫瘤細胞〔3〕。因為MTT試劑可被哺乳動物活細胞線粒體中的脫氫酶吸收,將黃色的MTT試劑還原成藍色不溶解的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細胞數目及細胞活化狀態呈線性關系。因此，該方法被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細胞毒性實驗研究,具有一定的客觀性。

流式細胞術結果顯示，不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對Hep-2細胞周期各時相均有影響。細胞周期是由G1、S、G2和M所組成的一個復雜過程〔4〕，其進程受各種細胞周期調節因子的嚴格控制，任何一個環節失控即可發生形態學改變，實驗結果顯示，斑蝥酸鈉維生素B6制劑可阻滯Hep-2細胞G1期向S期轉化進程，G1期細胞增多，S期細胞減少，從而造成G2/M期細胞相對增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應〔5〕，這一點從細胞凋亡率上得到了證實。文獻報道〔6〕，斑蝥酸鈉可使多鐘腫瘤細胞阻滯于G1期，G1期細胞是指細胞從有絲分裂到DNA復制階段，G1期是制造和產生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，而且G1期糖元合成最為顯著，G1期也是化學藥物作用的敏感點〔7〕。因此，抑制細胞G1期RNA的合成，從而使腫瘤細胞增殖變緩。

綜上所述，斑蝥酸鈉有明顯的抑制Hep-2細胞增殖效應，有良好的量效關系。隨著對斑蝥酸鈉衍生物抗腫瘤機制研究的不斷深入，其在抗癌治療中的應用必將越來越廣泛。

4 參考文獻

1劉展華，曹 洋，陳銳深，等.斑蝥酸鈉對人肺癌LAC細胞增殖的抑制作用〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2008;19(1)：32-3.

2劉忠虎，陳艾江，馬新剛,等.斑蝥酸鈉維生素B6注射液輔以胸腔鏡內臟神經切斷術治療癌性腹痛〔J〕.國際腫瘤學雜志，2013;40(5)：398-9.

3趙珍珍，李 俊，王維剛,等.不同癌細胞系對斑蝥酸鈉的藥物敏感性檢測〔J〕.同濟大學學報(醫學版)，2013;24(4)：10-5.

4Martin LG,Demers GW,Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human papiloma virus type/6 E7-expressing human cells is associated with altered regulation of cyclin E 〔J〕.J Virol,1998;72(2):975-85.

5Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like (PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss,2000;5(6):491-8.

6劉展華，曹 許，林麗珠,等，斑蝥酸鈉對人肺癌LAC細胞周期的影響及分子機制的研究〔J〕.廣州中醫藥大學學報，2007;24(6)：486-9.

7Brtek J,Lukas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in response to DNA damage 〔J〕.Curr opin Cell Biol,2001;13(6):738-47.