沉默信息調節因子1在腎臟衰老中的作用

葉 婷 寧 勇

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院臨床營養科，湖北 武漢 430030)

衰老是一個極為復雜的過程，受多種因素調控。目前關于衰老的理論主要有自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說和衰老的基因學說等〔1〕。氧化損傷在腎臟衰老的發生發展中起著重要作用。沉默信息調節因子1(Sirt1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，可通過調控新陳代謝(熱量消耗、脂肪貯存等)、維持氧化應力下線粒體的正常功能、抑制炎癥以及細胞凋亡等多個方面延緩細胞的衰老〔2〕。過去幾年，Sirt1已成為衰老研究中的主要領域，但對于Sirt1在腎臟衰老氧化損傷中的作用還鮮有報道。本文旨在探討Sirt1在腎臟衰老氧化損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組及標本留取 SD雄性大鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)，常規條件下于實驗動物中心分籠飼養，保持12 h的晝夜循環，室溫控制在23℃左右，濕度40%～50%，自由進食水。分別飼養至3、24個月齡(青年組、衰老組，n=10)，斷頭處死，放血干凈，生理鹽水沖洗腎臟。一側腎臟迅速分割后，一半置于液氮保存，隨后-80℃保存留待蛋白質等檢測中使用，一半留作病理檢查。對側腎臟立即制備組織勻漿。

1.2方法

1.2.1腎臟組織病理學分析 腎臟組織石蠟切片(2～3 μm)常規脫蠟入水，PAS 染色，普通光鏡下觀察腎臟組織病理改變。

1.2.2腎臟組織H2O2含量測定 腎臟組織勻漿按照H2O2檢測試劑盒(BioAssay System’s peroxide assay kit，Hayward，CA)說明書進行。

1.2.3腎臟組織MDA測定 采用TBARS檢測試劑盒(Cat#10009055，Ann Arbor，MI)，操作參照說明書進行。

1.2.4Western印跡 檢測硝基酪氨酸(nitrotyrosine)和Sirt1的蛋白表達水平 各組分別取20 μg蛋白，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的BSA封閉2 h，用1∶1 000稀釋的nitrotyrosine(Santa Cruz，Cat #sc-101358)和Sirt1(Santa Cruz，Cat # sc-15404)一抗4℃孵育過夜，用TBST振搖洗膜10 min×3次，以1∶5 000稀釋的羊抗兔生物素標記二抗，室溫孵育2 h后，再次用TBST振搖洗膜10 min×3 次。ECL底物化學發光(Supersignal West Dura kit，Thermo Scientific)顯色后機器掃描存盤，以Scion Image 軟件進行條帶分析。

2 結 果

2.1腎臟組織病理學改變 衰老組可見腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細胞水腫、變性、壞死，部分小管囊狀擴張、萎縮，局灶性小管消失，間質增寬，炎性細胞浸潤。病變嚴重區域可見系膜增生，節段性腎小球硬化。見圖1。

圖1 腎臟組織病理改變(PAS，×400)

2.2腎臟組織H2O2含量 衰老組腎臟組織H2O2含量較對照組明顯升高〔(239.9±39.38)μmol/μg vs (110±19.49) μmol/μg〕(P=0.017)。

2.3腎臟組織MDA含量 衰老組腎臟組織MDA含量較對照組明顯升高〔(44.42±4.17) μmol/mg vs (26.23±1.43) μmol/mg〕(P<0.001)。

2.4腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達 衰老組腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達較對照組顯著增加(P=0.007)。見圖2。

2.5腎臟組織Sirt1蛋白表達 衰老組腎臟組織Sirt1表達較對照組明顯下降(P=0.002)。見圖3。

2.6Sirt1蛋白表達水平與MDA、H2O2、nitrotyrosine相關性分析 腎組織中Sirt1蛋白表達水平與MDA、H2O2含量及nitrotyrosine蛋白表達均呈線型負相關(r=-0.776、-0.808、-0.868，P均<0.05)。

圖2 Western印跡檢測腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達

圖3 腎臟組織SIRT1蛋白質表達

3 討 論

腎臟是衰老過程中人體器官中變化最為明顯的器官之一，正常人在超過40歲后，腎小球濾過率平均每年下降1%。腎臟衰老在形態上表現為體積和重量下降，皮質相對萎縮、腎小球硬化、系膜基質增殖、間質纖維化以及炎細胞浸潤〔3〕。

衰老是一個極為復雜的過程，受多種因素調控。腎臟內的氧供十分豐富，血供量大，是機體內最易產生氧自由基的器官之一。衰老的自由基理論認為衰老是自由基對細胞成分的有害進攻造成的。氧自由基造成的損害，一方面取決于氧自由基的產生，另一方面氧自由基的清除也起重要作用。氧自由基的產生及清除失去平衡是包括癌癥、2型糖尿病、肥胖相關性代謝性疾病、神經退行性疾病、心血管疾病等多種衰老相關疾病的重要發病機制。〔4〕

H2O2是一種極不穩定的氧化物，易在體內分解產生羥基自由基，造成細胞的脂質過氧化，并降解為MDA。MDA可與蛋白質、核酸及某些磷脂作用，使細胞膜的流動性和通透性發生改變，從而導致細胞結構和功能的改變，加速細胞老化過程，最終引起細胞損傷、凋亡和多種疾病的發生。nitrotyrosine為內源性過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)生成的特異性標志物，作為一種很強的氧化劑，可有效地氧化蛋白質巰基和鐵硫(Fe/S)中心酪氨酸殘基，使許多蛋白或酶失活，破壞線粒體結構，使DNA鏈斷裂，從而影響代謝、抑制呼吸酶、顯著減弱抗氧化酶清除氧自由基的能力、啟動脂質過氧化，參與介導多種原因造成的組織損傷。本研究發現，衰老組大鼠腎臟組織中H2O2、MDA 、nitrotyrosine的含量均較青年組顯著升高，因此可以推測氧化損傷代謝產物的產生介導腎臟固有細胞損傷、凋亡、變性壞死，從而導致腎小球硬化、間質纖維化等一系列病理及功能改變。

Sirt1是Sirtuins 家族最主要的成員，其靶蛋白包括組蛋白和轉錄因子等。作為最被廣泛和深入研究的Sirtuins家族成員，Sirt1在抗衰老、腫瘤、糖脂代謝和心血管系統中發揮重要作用〔4〕。Sirt1在腎臟組織中廣泛表達，在腎髓質表達明顯高于皮質，尤其高表達于內髓部〔5〕。以往研究已經發現，Sirt1可抑制機體氧化應激。在Sirt1轉基因小鼠模型中，適度上調Sirt1，可通過FOXO通路，促進過氧化氫酶表達，抑制機體氧化應激水平〔6〕。Vinciguerra等〔7〕研究發現，Sirt1可通過抑制氧化應激抑制心肌衰竭進程，改善心功能。Sirt1激活劑能增強視神經中Sirt1表達，減少氧自由基產生，阻止神經元的丟失和視神經的炎癥性脫髓鞘〔8〕。在COPD大鼠模型，Sirt1激活劑能增強心臟SOD活性，緩解心肌氧化損傷和心室重塑〔9〕。在H2O2處理的H9C2細胞，Sirt1激活劑能誘導線粒體NDUFA1，NDUFA2，NDUFA13和Mn-SOD表達，減少氧自由基產生，這種作用可以被Sirt1抑制劑煙酰胺所抑制〔10〕。本研究發現，衰老組腎臟組織Sirt1表達較青年組明顯下降，并且Sirt1表達與氧化損傷產物負相關。因此，我們推測，隨著年齡的增長，腎臟組織Sirt1表達逐漸降低，從而使機體抗氧化損傷的自我保護機制減弱，而介導腎臟衰老的發生發展。在近幾年的研究中，Sirt1已成為對于衰老和長壽具有關鍵作用的調控因子，在腎臟衰老中是否也能通過其他途徑發揮作用有待進一步研究。

4 參考文獻

1李凌娟，胡慶亮. SIRT1與衰老分子機理研究進展〔J〕.綠色科技,2013;5:292-4.

2Kume S, Kitada M, Kanasaki K,etal. Anti-aging molecule, Sirt1: a novel therapeutic target for diabetic nephropathy〔J〕. Arch Pharm Res,2013;36(2):230-6.

3Kanasaki K1, Kitada M, Koya D. Pathophysiology of the aging kidney and therapeutic interventions〔J〕. Hypertens Res,2012;35(12):1121-8.

4Mimura T, Kaji Y, Noma H,etal. The role of SIRT1 in ocular aging〔J〕. Exp Eye Res,2013;116:17-26.

5曹 榮，張曉燕，康繼宏，等。Sirt1 在腎臟疾病中的作用〔J〕.生理科學進展，2013;44(4):305-9.

6Salminen A，Huuskonen J，Ojala J，etal.Activation of innate immunity system during aging: NF-κB signaling is the molecular culprit of inflammaging〔J〕.Ageing Res Rev,2008;7(2):83-105.

7Vinciguerra M，Santini MP，Martinez C，etal.mIGF-1 /JNK1 /SirT1signaling confers protection against oxidative stress in the heart〔J〕.Aging Cell，2012;11(1):139-49.

8Khan RS, Dine K, Das Sarma J,etal. SIRT1 Activating compounds reduce oxidative stress mediated neuronal loss in viral induced CNS demyelinating disease〔J〕. Acta Neuropathol Commun,2014; 2(1):3.

9Hu YX, Cui H, Fan L,etal. Resveratrol attenuates left ventricular remodeling in old rats with COPD induced by cigarette smoke exposure and LPS instillation〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2013;91(12):1044-54.

10Li YG, Zhu W, Tao JP,etal. Resveratrol protects cardiomyocytes from oxidative stress through SIRT1 and mitochondrial biogenesis signaling pathways〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2013;438(2):270-6.