線粒體轉錄因子A參與軟骨細胞退變逆轉的機制

黃 彥 梁月屏 廖壯文 呂浩然 謝楚海

(廣州醫科大學附屬第二醫院骨外科，廣東 廣州 510260)

骨關節炎(OA)是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節病〔1〕。關節軟骨細胞的過度凋亡是OA發病的重要病理機制，而軟骨細胞的凋亡與線粒體關系密切，線粒體轉錄因子A(TFAM)是線粒體轉錄和復制的關鍵激活子，與細胞凋亡過程相逆〔2〕。本研究分析膝關節骨關節炎患者、正常關節軟骨細胞的線粒體DNA特征和TFAM表達的差異情況，以期闡明TFAM與OA發生、發展的關系。

1 資料與方法

1.1病例資料 選擇我院2011年10月至2012年10月的膝關節OA患者20例，入選OA組，同時設立因關節矯形等手術剩余的正常關節軟骨組織細胞20例。診斷標準：參照中華醫學會骨科學分會制定的OA診治指南(2007年版)的診斷標準〔3〕。納入標準：①女性患者，絕經1 年以上, 年齡55～65歲; ②符合上述的診斷標準； ③能夠收集到較為齊全的相關資料者并簽署知情同意書；④研究前患者均簽訂知情同意書。排除標準：①繼發性膝骨關節炎患者；②6個月內服用過影響骨代謝藥物的患者；③合并嚴重心、肝、腎以及其他系統疾病者,精神病及腫瘤患者；④不同意和配合進行研究的患者。

1.2收集樣本和建立軟骨細胞的體外培養體系

1.2.1關節軟骨的收集 取膝OA關節置換手術中取下關節軟骨。取下的軟骨組織置于含青霉素鈉/鏈霉素雙抗PBS液的無菌培養皿中，漂洗去除血細胞和關節滑液，清除滑膜組織。最后在含雙抗液的PBS液的無菌培養皿中用眼科剪將軟骨組織剪成1～3 mm大小的組織碎塊，注意使標本保持濕潤狀態。

1.2.2軟骨細胞的培養 無菌條件下取得標本后立即置入盛有PBS的無菌培養皿中，無菌生物柜中取材術中切除的關節全層軟骨片(去除周圍軟組織)，無菌手術刀片切塊，剪碎，加入PBS液沖洗，將軟骨移入離心管中，加入Ⅱ型膠原酶，37℃培養箱中消化，其中2 h后每隔20 min晃動離心管一次，至懸液變混濁確定為軟骨塊基本被消化。之后離心，棄上清液。加入完全培養基，充分吹打混勻后可獲得含有軟骨細胞的懸液。倒置顯微鏡觀察軟骨細胞培養各個時期的細胞形態，大小，分布。

1.2.3MTT比色法測細胞增殖 取對數生長期的兩種軟骨細胞，接種于96孔板，分別于培養24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，加入20 μl MTT孵育4 h后，再加入100 μl DMSO溶解形成的甲瓚晶體，振搖10 min，用酶標儀測定570 nm處的吸光度。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 采用PI/Annexin V法，參照BD公司凋亡檢測試劑盒的說明書操作，將待檢測的兩種軟骨細胞在染色液中(10 ml PI, 1 ml Annexin V-FITC, 10 ml上樣緩沖液和79 ml H2O)室溫孵育15 min后，應用用流式細胞儀在488 nm波長氬離子激光下以Elite軟件分析細胞凋亡率。

1.3線粒體DNA特征與線粒體轉錄因子A表達

1.3.1PCR引物及TaqMan探針 本實驗中所有引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成、標記。應用熒光檢測物質有報告基因FAM 和熄滅基因TAMRA。mtDNA D-loop HV1(Hipervariable region 1, HV1)上游引物5′-TTGCACGGTACCATAAATACTTGAC-3′，下游引物5′-GAGTTGCAGTTGATGTGTGATAGTTG-3′，TaqMan探針5′-CTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAAT-3′，片段長度128 bp。核β-globin基因上游引物5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游引物 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，TaqMan探針5′-CTCCTGAG GAGA AGTCTGCT-3′，片段長度110 bp。TFAM上游引物5′-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3′，下游引物5′-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3′，片段長度118 bp。β-actin上游引物5′-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3′，下游引物 5′-TACATGGTGGTGCCGCC-3′，片段長度270 bp。

1.3.2細胞線粒體DNA的提取 加RNase(200 μg/ml)于37℃、2～4 h消化RNA。之后，用酚、酚氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1) DNA以去除蛋白質、脂類等其他物質。純化后的線粒體DNA量較少，線粒體DNA溶液加入0．6倍體積異丙醇或沉淀緩沖液，置于-20℃下放置30 min，進行離心即得純凈的線粒體DNA。

1.3.3線粒體DNA拷貝數的實時熒光定量PCR檢測 以線粒體DNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數的標記。設計HV1和β-globin基因的引物及探針，對該基因片段進行PCR擴增，在繪制標準曲線的基礎之上，分別對待測樣本線粒體HV1和β-globin基因進行實時熒光定量PCR檢測。線粒體DNA的拷貝數計算公式：相對拷貝數/二倍體核基因組=2×HV1/β-globin。

1.3.4線粒體轉錄因子A表達的測定 RNA抽提及逆轉錄cDNA：按照RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。置于紫外分光光度計上波長為260 nm和280 nm處測量吸光值，計算兩者的比值，選取比值在1.7～2.0者用于逆轉錄反應。cDNA合成嚴格按試劑盒說明書進行，合成的cDNA儲存在-20℃用于PCR反應。定量PCR反應：加入上下游引物各，在7500 Real Time PCR儀監測TFAM的表達差異。產物鑒定：取RT-PCR產物加入buffer，經電泳后，溴乙錠染色。

1.4統計學處理 用SPSS16.0軟件行方差分析及χ2檢驗。

2 結 果

2.1倒置顯微鏡觀察 分離原代軟骨細胞呈球形，大小均一。正常組原代軟骨細胞呈圓形或橢圓形，貼壁較快，6 d后長滿瓶壁，傳代后增殖加快，隨著傳代次數增加，細胞由橢圓形變為梭形細胞。而OA組原代細胞貼壁晚，單層集落樣，細胞形態多不規則，傳代后細胞以梭形為主，貼壁緩慢，4 d左右長滿瓶壁。

2.2MTT試驗 正常組增殖在24、48、72、96、120 h均較OA組明顯旺盛(P<0.01)，而OA細胞組增殖較慢，到72 h后趨向平臺期。見表1。

表1 實驗各組MTT試驗結果圖±s)

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 OA組的凋亡率高于正常細胞組(P<0.01)，正常細胞凋亡率為1.65%，OA細胞凋亡率為7.11 %。2 μg/L IL-1β作用72 h后，正常細胞凋亡率為13.79%，OA細胞凋亡率為35.13 %。2 μg/L濃度的IL-1β對OA軟骨細胞的凋亡誘導強于正常組(P<0.01)。

2.4線粒體DNA拷貝數和TFMA mRNA表達量的變化 HV1和β-globin基因定量PCR標準曲線的相關系數分別為0. 996和0. 998，斜率分別為-3.148和-3.369。OA組線粒體DNA的平均拷貝數為(389±117)，而正常細胞為(756±185)，前者顯著低于后者(P<0.01)。

2.5TFMA mRNA表達量的變化及與線粒體DNA拷貝數的關系 定量RT-PCR結果顯示，OA組TFMA mRNA的表達量(TFMA/β-actin)為0.556±0.021，而正常細胞表達量為1.053±0.024，前者低于后者(P<0.05)。見圖1。表達量和線粒體DNA拷貝數之間有相關性(r=0.924，P<0.01)；在OA組中，線粒體DNA拷貝數和TFMA mRNA的表達水平也有相關性(r=0.906，P<0.05)。

圖1 各組TFMA mRNA表達

3 討 論

軟骨細胞、蛋白多糖和Ⅱ型膠原相互作用，共同維持軟骨的生理性狀，其中任何改變都可以引起軟骨的退變〔4〕。大量研究發現軟骨細胞凋亡的增加是OA病理改變的重要特征〔5〕，Johnson等〔6〕研究證實，無論是活體還是體外培養，OA軟骨中存在過度的軟骨細胞凋亡。Leong等〔7〕認為相比正常的軟骨細胞，OA的軟骨細胞所分泌的蛋白質發生改變，同時合成代謝活動減少、炎性細胞因子的增加和基質降解酶活躍，導致關節軟骨的損傷。Musumeci等〔8〕研究發現，OA患者不僅軟骨細胞的結構改變，較正常軟骨細胞凋亡的增加，而且基質鈣化和蛋白多糖減少。因此，在本研究選擇軟骨細胞作為研究OA的作用點，體外培養觀察表明原代正常組細胞附壁生長和增殖活性良好，具有較好的軟骨細胞生物學特性，而OA組軟骨細胞的貼壁和增殖較慢，傳代久后生物學特性基本消失，凋亡明顯增多，對相同濃度IL-1β的誘導反應敏感，提示分離的原代OA軟骨細胞符合軟骨細胞退變，為其研究提供了較好的實驗對象。

Musumeci等〔9〕的研究認為，線粒體的功能障礙是破壞了軟骨細胞在關節內微環境，從而導致了骨關節炎的發生〔10〕。OA的軟骨細胞線粒體功能障礙可能來自體細胞中的線粒體DNA突變或炎癥介質的直接影響，使軟骨基質鈣化和軟骨細胞凋亡的增加。線粒體的復制和轉錄過程需要核編碼的一些轉錄因子進行調控，在哺乳動物中起主要調節作用的因子是TFAM〔11〕。TFAM是由596 bp核苷酸編碼的25 kD蛋白，具有兩個短串聯的高親和力的高遷移率族蛋白(HMG)盒域，在結構上包含一個N端頭結構域、兩個HMG box結構域和一個C末端尾結構， 兩個HMG box之間還存在一個由27個氨基酸殘基組成的短連接區域。Rebelo等〔12〕的研究認為，TFAM與線粒體DNA在線粒體中結合成復合體，從而保持線粒體DNA結構的穩定性。本研究結果發現，OA軟骨細胞TFMA mRNA的表達量低于正常軟骨細胞，說明OA軟骨細胞中線粒體DNA拷貝數下降，調控其轉錄、復制的主要調節因子TFMA的表達也相應下調。Nakanishi等〔13〕研究后認為TFAM可以改善線粒體DNA的損傷和減少，由此產生的氧化還原調節炎癥反應；Woo等〔14〕研究了敲除線粒體TFAM基因的小鼠，發現其線粒體DNA出現缺失，同時出現線粒體的氧化損傷。

在軟骨細胞中線粒體轉錄因子A在線粒體DNA轉錄、復制、結構的維持和損傷修復及細胞凋亡中均起著重要作用。線粒體DNA自身遺傳結構改變和線粒體轉錄因子A等因素共同作用是導致OA軟骨細胞線粒體DNA拷貝數改變的原因。

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