急性心肌梗死后鉀通道KCNH2和KCNE2基因表達的變化

李秀娟 曾 超 丁家望 吳 輝 李 莉 李 松 李穩慧 姜玉蓉 楊 俊

(宜昌市中心人民醫院心血管內科，湖北 宜昌 443003)

鉀通道(kr)對心肌細胞的電生理穩定性調控起著非常重要的作用〔1，2〕。人類ether--go-go相關基因HERG基因編碼心臟快速延遲整流鉀電流(Ikr)，Ikr是心肌細胞動作電位3期快速復極的主要電流，在心臟動作電位復極化過程中發揮重要作用。HERG及其調節亞基KCNE2基因突變可引起LQTs 綜合征〔3，4〕。心肌梗死(MI)后心室肌膜多種kr基因表達的的變化已成為近年研究熱點，但是關于MI后krHERG基因表達變化的研究很少，尤其是對大型動物如豬的研究尚屬少見。本實驗用RT-PCR 方法觀察MI后左心室不同部位快速延遲整流鉀通道Kr基因HERG及其調節亞基KCNE2基因的mRNA表達改變及其意義，旨在探討急性心肌梗死(AMI)后早期室性心律失常發生的分子機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 普通級小型豬，體重10～15 kg(華中農業大學動物中心提供)，雌雄不限。術前常規檢查心電圖,心電圖異常者剔除，隨機分為假手術組和模型組(MI組)，共16只動物。

1.2MI動物模型的建立 所有實驗動物術前均禁食、禁飲12 h。術前稱重,予以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在口腔明視下行氣管插管,以呼吸機機械通氣,潮氣量10～15 ml/kg，給氧3～5 L/min，頻率20～25次/min。常規消毒鋪巾，于胸骨正中打開胸腔,縱行切開心包膜,充分暴露心臟,并將心包膜縫合于胸壁呈吊籃狀。仔細分離冠狀動脈,于冠狀動脈左前降支(LAD)遠端1/3～1/2處穿入4號縫合線,AMI組結扎2 h,再松解4 h,建立AMI模型,其成功標志為:心電圖ST段弓背向上抬高,直視下可見被結扎血管供血區心肌變為蒼白色。假手術組也重復上述步驟,但冠狀動脈下只穿線,不結扎。逐層縫合心包、胸壁，并放置引流管。術后精心喂養動物至實驗終點。取結扎后存活的豬,分入MI組,建立假手術組,所有豬均接受相同的飼養條件。

1.3標本的采集與保存 兩組均于術后24 h,用3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速取出心臟置于4℃預冷的生理鹽水漂洗除去血液，MI組取左心室梗死區,梗死邊緣區,非梗死區心肌組織各300 mg,同樣留取SH組左心室對應部位心肌組織各300 mg,立即放入液氮中保存備用。

1.4心肌總RNA的提取和KCNH2和KCNE2 mRNA檢測 取50～100 mg豬心肌,應用TRIZOL勻漿，提取組織總RNA，紫外光檢測樣品吸光度，A260/A280為1.95-2.10。應用RT-PCR法(通用RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司)檢測mRNA的表達,50℃ 30 min,94℃預變性2 min,PCR擴增29個循環(94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸4 min)后，1.5%瓊脂糖電泳分析PCR產物,應用凝膠成像系統觀察記錄結果,用光密度掃描計算KCNH2電泳條帶灰度積分/β-actin電泳條帶灰度積分和KCNE2電泳條帶灰度積分/β-actin電泳條帶灰度積分，進行半定量分析。各目的基因引物及β-actin引物序列、片段長度、退火溫度見表1。

表1 目標基因與內參基因引物序列及PCR反應條件

1.5統計學分析 應用SPSS11.5軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1動物存活情況 MI組中9只豬存活6只,另外3只于術中發生室顫，經心內除顫無效死亡;假手術組中7只豬，1只因麻醉意外死亡,其余6只存活。

2.2豬心肌KCNH2和KCNE2基因mRNA表達的變化 假手術組KCNH2和KCNE2 mRNA的表達在梗死對應區、梗死邊緣對應區、非梗死對應區之間無明顯差異(P>0.05)(見圖1、圖2)。MI 組KCNH2 mRNA 表達在梗死區較假手術組下調(P<0.05)；在梗死邊緣區較假手術組下調(P<0.05)；在非梗死區較假手術組無明顯差異(P>0.05)。同時，KCNH2 mRNA 表達在梗死區和梗死邊緣區無明顯差異(P>0.05)，但較非梗死區下調(P<0.05)(見表2及圖1)。MI 組KCNE2 mRNA 表達在梗死區較假手術組降低(P<0.05)，而梗死邊緣區和非梗死區較假手術組無明顯差異(P>0.05)。同時KCNE2 mRNA 表達在梗死區較梗死邊緣區和非梗死區下調(P<0.05)，但梗死邊緣區和非梗死區之間的表達無明顯差異(P>0.05)(見表2及圖2)。

表2 兩組不同部位KCNH2、KCNE2基因mRNA的表達±s)

1：MI組梗死區；2：MI組梗死邊緣區；3：MI組非梗死區；4：假手術組梗死對應區；5：假手術組梗死邊緣對應區；6：假手術組非梗死對應區；下圖同

圖2 兩組不同部位KCNE2 RT-PCR電泳圖

3 討 論

近年來，人體遺傳分子學和生物學對先天性Q-T間期延長綜合征的研究，已突破性地揭示出心肌細胞有關離子通道基因表達的缺陷與心肌節律紊亂之間的關系，表明通道基因表達的異常是心律失常產生的機制之一〔5〕。kr在心肌細胞的電生理穩定性調控中起著非常重要的作用。IKr是HERG(KCNH2)和KCNE2(MiRP1)表達的兩種蛋白質共同形成功能性kr，KCNH2本身單獨可產生一種小的快速激活外向Ikr，KCNE2本身并不能產生任何離子電流，但它的存在主要影響通道的門控性和藥理學性質。HERG及其調節亞基KCNE2基因突變可引起LQTs 綜合征。但在MI后HERG及其調節亞基KCNE2基因的表達有何改變，這些改變在心律失常中所起的確切作用尚不是很清楚。Pinto等〔6〕研究發現MI后24 h犬的浦肯野纖維細胞上對E-4031敏感的電流增加，但是這種電流在正電位時缺乏內向整流特性，所以說這種電流也并非是真正意義上的Ikr。Jiang等〔7〕研究發現MI后2 d犬心室肌細胞的延遲整流Ikr的幅度減低及其動力學發生改變，Ikr激活和Iks失活加速，他們認為這些變化歸因于有功能的相應通道減少和/或通道亞單位成分的改變。Huang等〔8〕在大鼠MI模型研究中發現Ikr密度呈時間依賴性降低，動作電位時程延長，認為這些變化是MI后心臟早期致心律失常的原因。由此可見，MI后Ikr電流的電生理特性發生了改變，這可能是MI后易發心律失常的機制之一。

本研究KCNH2mRNA變化可能是MI后Ikr電流電生理特性發生改變的分子基礎。KCNH2基因mRNA的表達水平下調，可以造成有功能的快速延遲整流kr的數目減少，有助于Ikr電流的減小，可能是心肌細胞在恢復期的一種代償性保護性反應，使膜Ikr變小，鉀離子外流減少，促進急性缺血所造成的細胞內外K+平衡失調的恢復。但是Ikr電流的減小，可使心室肌細胞APD延長，心肌細胞電生理特性改變，易于形成觸發活動，產生心律失常。同時KCNE2基因mRNA表達水平的下調，使Ikr在整體行為，對細胞外K+及抗心律失常藥物的敏感性和通道的失活速率等方面發生改變，增加了電流的不穩定性和發生心律失常的易感性。再者由于，KCNH2和KCNE2 mRNA的表達在梗死區、梗死邊緣區、非梗死區之間產生了明顯的差異，使空間異質性增大，可導致復極不均一，復極離散度增大，易于形成折返發生心律失常。

因此，kr基因KCNH2和KCNE2 mRNA表達的下調和在不同部位改變的不均一可能在電生理不穩定的維持和(或)惡化方面起一定的作用，但這種變化的確切意義和KCNH2和KCNE2基因兩者之間的相互作用還有待深入研究。

4 參考文獻

1Pongs Olaf.Ins and outs of cardiac voltage-gated potassium channels〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2009；(3):311-5.

2Shimizu Wataru,Horie Minoru.Phenotypic manifestations of mutations in genes encoding subunits of cardiac potassium channels〔J〕.Circulation Res，2011；109(1):97-109.

3Roden DM.Long-QT syndrome〔J〕.N Eng J Med，2008；358(2):169-76.

4Sanguinetti MC.ERG1 channelopathies〔J〕.Pflugers Arch-Eur J Physiol，2010；60(2):265-76.

5Cummings S,Priori G.Genetics of cardiac arrhythmias〔J〕.Inerva Med，2011；102(3):209-22

6Pinto JMB,Boyden PA.Reduced inward rectifying and increased E-4031-sensitive K+ current density in arrhythmogenic subendocardial Purkinje myocytes from the infarcted heart〔J〕.J Cardio Electrophy，1998；9:299-311.

7Jiang M,Yao JA,Wymore RS,etal.Suppressed transcription and function of delayed rectifier K channels in post-infarcted heart〔J〕.Circulation，1998；98:811-8.

8Huang B,Qin D,El-Sherif N.Early down-regulation of K channel genes and currents in the post-infarction heart〔J〕.J Cardiol Electrophy,2000;11(11):1252-61.