局灶性腦缺血大鼠VEGF/Notch1信號(hào)分子的表達(dá)及腦泰方的調(diào)節(jié)作用

陳 懿 葛金文 廖 君 蘇 浩

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

近年來(lái)，血管新生在缺血性腦梗死中的修復(fù)作用已引起廣泛關(guān)注。近年來(lái)許多研究表明，腦缺血時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)作為最重要的血管生成因素之一，表達(dá)增加，促使血管形成。在血管生成過(guò)程中，VEGF誘導(dǎo)Notch信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)。Notch信號(hào)通路是生物體進(jìn)化中高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作用具有多樣性，參與了正常血管生成、缺血后損傷血管的修復(fù)等過(guò)程，為腦缺血治療新的生物學(xué)靶點(diǎn)〔1,2〕。益氣活血法是臨床上治療缺血性腦卒中常用的中醫(yī)治法。以往研究已證實(shí)益氣活血中藥腦泰方促進(jìn)局灶性缺血腦組織VEGF的表達(dá)，有治療性血管新生樣作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)采用線(xiàn)栓法制作局灶性腦缺血大鼠模型，觀(guān)察腦泰方對(duì)局灶性腦缺血大鼠缺血半暗帶區(qū)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討其促進(jìn)腦缺血損傷后治療性血管新生樣作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物、主要試劑及儀器 腦泰方由黃芪、川芎、地龍等藥物組成，經(jīng)水煎、醇提后制成浸膏粉(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室提取，每1 g浸膏粉含生藥4 g)；Trizol 購(gòu)自美國(guó)INVITROGEN公司， RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)MBI公司。重組人血管內(nèi)皮抑制素(ED)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。VEGF、Fk-1、Notch1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。日本Olympus公司BX51光學(xué)顯微鏡及Motic Image Advanced 3.0 圖像分析系統(tǒng)，Biomatra公司Tgradient PCR儀。

1.2動(dòng)物分組與給藥 65只雄性清潔級(jí)成年SD大鼠，體重250～280 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(滬) 2008-0016。按隨機(jī)數(shù)字表法抽取5只大鼠為假手術(shù)組(灌胃生理鹽水)，只分離血管，不插入線(xiàn)栓，飼養(yǎng)28 d后取材。其余60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(MCAO組，灌胃生理鹽水)、腦泰方提取物組(NTF組，灌胃腦泰方提取物，0.72 g/ml)及NTF+ED(血管內(nèi)皮抑制素)組，每組20只。參照Longa等〔4〕的方法并加以改進(jìn)制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)。模型成功的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考Bederson等〔5〕對(duì)栓塞后大鼠的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)作神經(jīng)功能缺失評(píng)分，分值在1～3分者入選，死亡不足動(dòng)物隨機(jī)替補(bǔ)。模型成功后24 h腹腔注射恩度(2.5 mg/kg，前3 d每天1次，之后每周2次)。各組再按不同時(shí)間點(diǎn)以隨機(jī)數(shù)字表法再分成4組，每組5只，分別于腦缺血后1、7、14、28 d取材。

1.3RT-PCR法檢測(cè)VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的含量 ①引物合成：引物設(shè)計(jì)，參考電腦基因庫(kù)核苷酸序列資料，由上海生工生物工程公司合成純化。VEGF的引物序列:正義鏈引物：5'-CGCCAAGCCCGGAAGATTAG-3'，反義鏈引物：5'-CCAGGGATGGGTTTGTCGTG-3'。Flk-1的引物序列:正義鏈引物：5'-CTGTGCTGTTTCCTACCCTAATC-3'，反義鏈引物：5'- CTTTACCGTCGCCACTTGAC-3'。Notch1的引物序列: 正義鏈引物: 5'- AATGGAGGGAGGTGCGAAG-3',反義鏈引物：5'-ATGGTGTGCTGAGGCAAGG -3'。GAPDH的引物序列：正義鏈引物：5'-AACTCCCTCAAGATTGTCAG-3'，反義鏈引物：5'-GGGAGTTGCTTGAAGTCACA-3'。②腦組織總RNA的提取，采用異硫氰酸胍法。③PCR產(chǎn)物分析：取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在2.5%的瓊脂糖凝膠電泳上做擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)分析，電壓50V，30～45 m，溴乙啶染色。紫外燈下拍攝觀(guān)測(cè)電泳條帶，激光密度掃描儀掃描底片。計(jì)算曲線(xiàn)下峰面積作為PCR產(chǎn)物含量。用下列公式計(jì)算VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的表達(dá)水平。產(chǎn)物的含量=Notch1(VEGF、Flk-1)擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值/參照系統(tǒng)GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值。

1.4Western 印跡法檢測(cè)VEGF、Flk-1、Notch1蛋白的表達(dá) Western印跡法檢測(cè)VEGF、Flk-1、Notchl的表達(dá)：按照總蛋白提取試劑盒進(jìn)行，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。變性后取40 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)膜到PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入相應(yīng)一抗：小鼠抗大鼠Notchl抗體(濃度1∶100)，兔抗大鼠Flk-1抗體(濃度1∶200)和兔抗大鼠VEGF抗體(濃度1∶200)，4℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗孵育1 h，ECL顯影，X光片暗室中感光，圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄光密度強(qiáng)度。設(shè)β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果以IOD值表示。以假手術(shù)組的相對(duì)灰度值作為標(biāo)準(zhǔn)，其他各組的IOD值分別進(jìn)行標(biāo)化，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠缺血周邊區(qū)VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的表達(dá) 假手術(shù)組中，VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA均呈低水平的表達(dá)；MCAO組中，VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA表達(dá)在術(shù)后7 d開(kāi)始升高，14 d 達(dá)高峰；NTF組中，同樣在術(shù)后7 d VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，14 d 達(dá)高峰，并且各時(shí)間點(diǎn)比同時(shí)相MCAO組升高更明顯(P<0.05)；而在NTF+ED干預(yù)組中，VEGF、Flk-1和Notch1 mRNA的表達(dá)低于NTF組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 腦泰方提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠VEGF mRNA、Flk-1 mRNA和 Notch1 mRNA 表達(dá)的影響±s，n=5)

2.2大鼠腦缺血周邊區(qū)VEGF、Flk-1、Notch1的蛋白表達(dá) MCAO組VEGF蛋白在術(shù)后7 d表達(dá)開(kāi)始升高， 14 d達(dá)高峰；NTF治療組中，VEGF蛋白表達(dá)同樣在術(shù)后7 d開(kāi)始升高，14 d達(dá)高峰，且與同時(shí)相MCAO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與NTF組比較，NTF+ED組各時(shí)相的VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 腦泰方對(duì)缺血腦組織VEGF 蛋白含量的影響±s，n=5)

2.2.1各組Flk-1蛋白表達(dá)情況 MCAO組Flk-1蛋白在14 d 表達(dá)開(kāi)始升高，NTF組在術(shù)后7、14和28 d Flk-1蛋白表達(dá)高于同時(shí)相MCAO組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與NTF組比較，NTF+ED組各時(shí)相的Flk-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，尤其是術(shù)后7 d (P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 腦泰方提取物對(duì)缺血腦組織Flk-1蛋白含量的影響±s，n=5)

2.2.2各組Notch1蛋白表達(dá)情況 MCAO組Notch1蛋白表達(dá)在7 d 表達(dá)開(kāi)始升高， 14 d達(dá)高峰；NTF治療組中，Notch1蛋白表達(dá)在各時(shí)相升高顯著，與MCAO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NTF組比較， NTF+ED干預(yù)組各時(shí)相的VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 腦泰方提取物對(duì)缺血腦組織Notch1蛋白含量的影響±s，n=5)

3 討 論

缺血性腦損傷是一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其機(jī)制尚未完全闡明。MCAO動(dòng)物模型顯示，血管新生在缺血1～2 w明顯可見(jiàn)，在缺血半暗帶區(qū)最為明顯〔6〕。Marti 等〔7〕的研究表明，MCAO 后24 h 血管內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始增生，血管樣結(jié)構(gòu)從軟腦膜和腦實(shí)質(zhì)的血管向缺血區(qū)發(fā)展。本課題組前期研究亦證實(shí)，腦缺血后，缺血組織血管新生明顯。血管的新生及調(diào)控涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路。近年來(lái)認(rèn)為最重要的是VEGF及Notch信號(hào)通路。永久性局灶性腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF表達(dá)于缺血后2～14 d內(nèi)持續(xù)增高，新血管的形成始于缺血后6～24 h，并一直延續(xù)28 d〔8〕。炎癥反應(yīng)及一些藥物可通過(guò)VEGF及其受體促進(jìn)血管發(fā)生及損傷后的恢復(fù)〔9,10〕。而VEGF亦可誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Notch信號(hào)基因表達(dá)。研究也發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路對(duì)血管的發(fā)生發(fā)展，包括細(xì)胞增殖、遷移、平滑肌分化、血管生成、動(dòng)靜脈分化等多個(gè)方面有重要調(diào)控功能〔11〕。Notch信號(hào)家族包括Notch受體、配體及其相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。在脊椎動(dòng)物中目前共發(fā)現(xiàn)了4種Notch蛋白的同源體：Notchl、Notch2、Notch3和Notch4。Notch具有多種配體，哺乳動(dòng)物中有Delta1、Delta-like3(Dll3)、Delta-like4(Dll4)、Jaggedl、Jagged2。在血管系統(tǒng)中，Notch1受體及Dll4主要表達(dá)在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上。有研究證明，當(dāng)VEGF信號(hào)途徑被阻斷后，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Dll4的表達(dá)減少，從而使血管分支發(fā)育過(guò)程受阻〔12〕。

本研究前期研究發(fā)現(xiàn)腦泰方可促進(jìn)缺血側(cè)腦組織VEGF的表達(dá)，但其是否能進(jìn)一步上調(diào)Notch信號(hào)通路的表達(dá)，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提示腦泰方確有促進(jìn)腦缺血周邊區(qū)VEGF-Notch信號(hào)通路表達(dá)的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Angeliki L,Spyros AT.Notch and disease:a growing field〔J〕.Semi Cell dev Biol,2012;23(4):473-80.

2L-K P,Holher G.Angiogenesis:a team effort coordinated by notch〔J〕.Dev Cell,2009；16(2):196-208.

3陳 懿,王國(guó)佐,葛金文.腦泰方提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2009；24(2):205-7.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989；20(1):84-94.

5Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,etal.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination〔J〕.Stroke,1986；17(3): 472-6.

6Chen HH,Chen CH,Liu HM.Correlation between angiogenesis and basic fibroblast growth factor expression in experimental brain infarct〔J〕.Stroke,1994；25(8): 1651-7.

7Marti HJ,Bernaudin M,Bellail A,etal.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression precedes neovascularization after cerebral ischemia〔J〕.Am J Pathol,2000；156 (3): 965-76.

8Zhang ZG,Zhang L ,Tsang W,etal.Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of blood-brain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia 〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2002；22 (4): 379-92.

9Pillai A,Mahadik SP.Differential effects of haloperidol and olanzapine on levels of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in rat hippocampus〔J〕.Schizophr Res,2006；87 (1-3): 48-59.

10Chen J,Zhang C,Jiang H,etal.Atorvastatin induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(2): 281-90.

11Ehebauer M,Hayward P,Arias AM.Notch a universal arbiter of cell fate decisions〔J〕.Science,2006,314(5804): 1414-5.

12Suchting S,Freitas C,Noble F,etal.The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial tip cell formation and vessel branching〔J〕.Proc Natl Acad Sci,2007；104(9): 3225-30.