不同時間點腦出血大鼠腦組織中缺氧誘導因子1α和線粒體細胞色素C的表達

殷旭華 李冬梅 于慧玲

(內蒙古醫科大學附屬醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010050)

腦出血是發病率和致死率極高的腦血管疾病之一〔1〕。腦出血后輕微腦缺血伴隨著大量激活的細胞因子外滲及血腫周圍神經元死亡，是腦出血后神經細胞死亡的主要途徑之一〔2〕。因此如何阻斷腦出血后神經細胞凋亡成為研究熱點，本實驗探討缺氧誘導因子(HIF)-1α和線粒體細胞色素(Cyt)-C在腦出血大鼠腦組織中的表達及與腦神經細胞凋亡之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康的Wistar老年雄性大鼠(20月齡)120只(吉林大學基礎醫學部動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK2007-吉大-0003)，體重(370±20)g。

1.2實驗試劑及儀器 HIF-1α、Cyt-C的ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司；Trizol、HIF-1α和Cyt-C的引物、反轉錄試劑盒均購于Takara生物有限公司。Biotek Epoch酶標儀(美國)；實時熒光定量PCR儀(型號ABI7300，美國)；Biometra PCR擴增儀(美國)；腦立體定位儀(NARISH IGE SN-3型)。

1.3腦出血模型制備〔3〕采用自體尾動脈血尾狀核定位注入法建立腦出血模型。動物稱重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)。麻醉成功后，固定大鼠，在腦立體定位儀引導下用微量進樣器向尾狀核(以前囟為原點R 3.0 mm，A 0.2 mm，H 5.0 mm)注入自體不加抗凝劑的尾動脈血50 μl。假手術組:尾狀核部位打孔進針、不注血，其他同模型制備。

1.4實驗分組 隨機分為假手術組和腦出血模型組各60只；兩組按時間點分組：12、24、48、72 h、5和7 d組(n=10)。

1.5大鼠腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的檢測 采用ELISA法檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6大鼠腦組織中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的檢測 取冷凍腦組織60～100 mg，用Trizol提取總RNA，應用實時多聚酶鏈反應(RT-PCR)法測定HIF-1α、Cyt-C mRNA的表達。根據Takara試劑盒說明書方法逆轉錄合成cDNA。引物序列：GAPDH(252 bp)上游5′-GACAGCAACAGGGTGGACG-3′，下游5′-GTTTGAGGGTGCAGCGAACTTG-3′；HIF-1α(198 bp)上游5′-TCAAGTCAGCAACGTGGAAG-3′，下游5′-TATCGAGGCTGTGTCGACTG-3′；Cyt-C(110 bp)上游5′-GTTGGACAGCCCCGATGTTAG-3′，下游5′-TTGAGAAAGGGAAAGGCAGTGATG-3′。

1.7統計學處理 采用SPSS13.0統計學軟件進行t檢驗。

2 結 果

與假手術組比較，腦出血模型組不同時間點腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.001)，72 h達高峰，隨后逐漸下調。腦出血模型組術后12、24、48 h、5、7 d與72 h HIF-1α、Cyt-C的蛋白和mRNA水平有統計學差異(P<0.01)，48 h與5 d無統計學差異(P>0.05)。見表1和表2。

表1 各組腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的比較 (n=10,±s,pg/ml)

表2 各組腦組織中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的比較 (n=10,±s)

3 討 論

腦出血后血腫周圍的繼發性損傷導致神經元細胞發生壞死或凋亡。HIF-1α是一種隨著細胞內氧濃度變化而調節基因表達的轉錄激活因子，任何氧濃度降低的條件下都可誘導細胞快速、大量的表達，在調節缺氧誘導的基因表達中起重要作用〔4〕。HIF-1α表達增高可促進半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達，促進細胞凋亡，加重腦水腫、病理學改變和炎癥反應程度及神經功能障礙〔5〕。Cyt-C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，定位于線粒體內膜上，是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分〔6〕。細胞凋亡是受多基因調控的程序性細胞死亡，而線粒體Cyt-C是凋亡的重要啟動因子之一〔7〕。凋亡過程中通過線粒體外膜釋放至胞質導致Cyt-C缺乏，從而電子傳遞鏈被阻斷，導致ATP合成減少和不完全氧化造成活性氧(ROS)過度生成，導致線粒體外膜孔道的開放，進一步引發線粒體內容物的釋放，從而形成一個放大效應的惡性循環〔8〕。HIF-1α與低氧促進Caspase-3的表達密切相關、Cyt-C參與細胞有氧呼吸活動并在誘導細胞凋亡方面有重要意義。本實驗結果提示，腦出血后腦組織中HIF-1α、Cyt-C的蛋白及mRNA水平增高可促進神經細胞凋亡、導致神經功能障礙及加重繼發性腦損傷，阻斷二者的表達，為腦出血的治療提供新的靶點。

4 參考文獻

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2李瑞瑞,龐 曉.血同型半胱氨酸與高血壓患者腦出血的關系〔J〕.中華高血壓雜志,2014;22(2):181-3.

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4郭守剛,劉慶新,黃秀梅,等.腦出血灶周缺氧誘導因子-1α的表達及其神經細胞凋亡的實驗研究〔J〕.中風與神經疾病雜志,2005;22(3):224-6.

5李曉玲,王滿俠,張 博,等.亞低溫對腦出血后非caspase酶依賴性凋亡通路的影響〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志,2014;21(1):44-7.

6代全德,張建平,路文革,等.腦出血血腫周圍腦組織細胞凋亡與細胞色素C表達的關系〔J〕.中國實用神經疾病雜志,2009;12(7):38-40.

7Matsushita K,Meng W,Wang X,etal.Evidence for apoptosis after intercerebral hemorrhage in rat striatum〔J〕.J Cereb Blood Folw Metab,2000;20(8):396-404.

8張 云,劉 斌.腦出血后繼發性腦損傷的細胞凋亡機制研究進展〔J〕.中國康復醫學雜志,2007;12(6):1130-3.