姜黃素對肝癌細胞株HepG-2的抑制作用

王丹丹 汲 軍 項柏冬

(長春醫學高等?？茖W校，吉林 長春 130031)

肝癌在腫瘤發病率中位列第三。確診時常常已到晚期,預后差,嚴重威脅著人類健康。常用的放化療手段有一定療效,但常給機體帶來嚴重的副作用。因此，尋找高效低毒的化療藥物，和毒副作用小的純中藥制劑來輔助治療肝癌成為國內外學者研究的熱點。姜黃素(CUR)是從姜黃中提取的天然藥物成分，其藥理作用廣泛，主要有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、脂質過氧化、抗病毒等〔1〕。它具有毒副作用低、價格低廉等優點。許多動物體內實驗證實，CUR可抑制胃癌、皮膚癌、結腸癌等癌癥的發生，具有明顯的抗腫瘤效果。本文主要研究CUR在體外對人肝癌細胞株(HepG-2)的抑制效果，探討CUR的抗腫瘤活性，以期為CUR的體內活性及臨床應用研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1儀器、試劑、藥品 Bio-RAD550全自動酶標儀：美國伯樂公司；臺式高速低溫離心機5810R型：德國Eppendorf公司；二氧化碳培養箱：美國Forma公司；電子天平：北京賽多利斯有限公司；Olympus倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：美國Sigma公司。RPMI-1640培養基：Gibco公司；小牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；無水二甲基亞砜(DMSO)：分析純，美國Sigma公司；胰酶：美國Sigma公司；吉姆薩染液：德國AppliChem公司；姜黃素(含量>80%)：美國Sigma公司。細胞株：HepG-2購買于上海生物制品研究所，液氮中凍存保種。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HepG-2接種于含雙抗的RPMI-1640培養基并加入FBS培養，置于5%CO2飽和濕度、37.5℃的恒溫培養箱中培養24 h后即進入對數生長期，接種后72 h后細胞貼壁生長，用0.25%胰酶將貼壁生長的細胞用直接吹打法傳代，每1～2 d更換1次培養基，選擇對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2CUR溶液的配制 將CUR粉劑用少量DMSO溶解，配成1 mmol/L儲備液，置于冰箱-20℃中儲存備用，實驗前解凍，用時稀釋至所需藥物濃度(DMSO終濃度<0.1%)。

1.2.3分組 空白對照組：加入0.1%DMSO的RPMI-1640培養基和細胞；CUR組：共設6個濃度組(5，10，20，30，40，50 μg/ml)，每孔加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培養基、細胞和相應濃度的CUR。

1.2.4MTT法檢測藥物對細胞株增殖的影響 取消化后的對數生長期的HepG2，分別以濃度為1×104個/ml的細胞密度接種于96孔培養板中，加入量為200 μl/孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中孵育培養24 h。待細胞貼壁生長后加入上述分組濃度的CUR溶液，加藥量為200 μl/孔，每組設6個平行孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續孵育4 h。小心吸去培養基上清液，每孔再加入DMSO 150 μl振蕩混勻10 min，使結晶充分溶解。用酶標儀選擇490 nm波長，空白孔調零，測定各孔吸光度A值，并計算細胞生長抑制率(IR) 。實驗重復3次，取平均值，根據細胞IR判定藥物對細胞增殖的影響。IR=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.5集落形成試驗檢測藥物對增殖的抑制作用 貼壁細胞采用平板克隆法：按100/ml、1 ml/孔接種細胞于24孔板，待細胞貼壁24 h后，實驗組加入不同濃度的姜黃素(5，10，50 μg/ml)，對照組加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培養基，每組設3個復孔，于 CO2培養箱中培養7～10 d，待培養板中出現肉眼可見的集落時，終止培養。棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心浸洗2次。加甲醇0.5 ml/孔，固定15 min，棄去固定液，加2～3滴姬姆薩染液染色20～30 min，然后緩慢流水洗去染色液，空氣干燥。肉眼觀察并計數細胞集落(≥50 個細胞者計為一個集落)。按以下公式計算集落形成抑制率：集落形成抑制率=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%

1.2.6細胞形態學觀察 將加藥后的HepG2，培養48 h后，在倒置顯微鏡下放大200倍觀察細胞變化并拍照。

2 結 果

2.1細胞形態學觀察 鏡下觀察顯示，對照組細胞形態伸展,輪廓清晰,成對數生長，加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR的實驗組，各濃度CUR組喜寶生長受到抑制，細胞體積縮小呈圓形，與周圍的細胞脫離。見圖1。

2.2MTT法測定CUR對HepG-2的增殖抑制率 與空白對照組比較，各個濃度的CUR實驗組對HepG2均有明顯的抑制作用(P<0.05)，并且，隨著CUR濃度的增大,對癌細胞的抑制作用越明顯，表明CUR可以明顯抑制HepG2的增殖，達到控制癌細胞擴散的作用。見表1。

A為空白對照組；B～G分別為加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR實驗組

2.3CUR抑制腫瘤細胞集落形成 不同濃度的CUR(5，10，50 μg/ml)的抑制率分別為0.550±0.183，0.201±0.086，0.058±0.011。試驗結果顯示，隨著藥物濃度的升高，給藥組的集落生長速度較對照組慢，腫瘤細胞所形成的集落數目也逐漸減少，集落形成抑制率逐漸增加。見圖2。

表1 CUR對HepG2細胞的抑制作用±s)

圖2 CUR作用的肝癌細胞HepG-2集落形成圖

3 討 論

姜黃是郁金屬姜科植物姜黃干燥根莖的主要成分,始載于《新修本草》,具行氣滯、散風活血而止痛之功效,常用于利膽、消炎、抗菌等治療。CUR是姜黃的主要成分,也是咖喱、芥末中的主要黃色色素,屬于天然植物多酚類抗氧化劑,由于其無毒，在亞洲許多國家被廣泛用于調料及食用色素。CUR抗腫瘤的作用由印度學者Kuttan等〔2〕在1985年首次提出，發現CUR可明顯抑制中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)和Dultoncs淋巴瘤細胞的生長，體內實驗也初步證實CUR對小鼠艾氏腹水瘤生長具有抑制作用。隨后CUR的抗腫瘤作用日益引起人們的重視，美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學預防藥。

本實驗結果表明CUR對HepG2細胞有較強的增殖抑制作用。為CUR用于體內的抗腫瘤活性研究提供了科學依據。

4 參考文獻

1Kunnumakkara AB,Anand P,Aggarwal BB.Curcumin inhibits proliferation,invasion,angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins〔J〕.Cancer Lett,2008;269(2):199-225.

2Kuttan R,Bhanumathy P,Nirmala K,etal.Potential anticancer activity of turmeric(Curcuma longa)〔J〕.Cancer Lett,1985;29(2):197-202.