SATB1基因?qū)π〖毎伟┰鲋场⑶忠u及凋亡的影響

黃 波 王曉東 郎賢平

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000)

小細胞肺癌(SCLC)是一種特殊類型的肺癌，占肺癌的15%～20%。SCLC侵襲性強，生長迅速且早期容易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移〔1〕。雖然SCLC對化療和放療敏感，但它容易復(fù)發(fā)和耐藥。因此尋找SCLC的相關(guān)基因尤顯重要。富含AT-序列結(jié)合蛋白1(SATB1)是一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白，參與染色質(zhì)合成和組織特異性基因表達〔2〕。 SATB1主要表達在胸腺細胞其調(diào)控T細胞的發(fā)育與成熟〔3〕。 有報道顯示SATB1與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有一定的相關(guān)性〔4〕。RNA干擾SATB1可引起侵襲性較強的癌細胞超過1 000個基因的表達改變，并能有效地抑制細胞的增殖，侵襲，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。SATB1-RNAi技術(shù)已證實其對于肝癌細胞、胃癌細胞等腫瘤細胞的侵襲能力均有一定的抑制作用〔5～9〕，而在SCLC細胞中SATB1基因的干擾RNA的效果尚缺乏報道。本研究將針對SATB1-siRNA對SCLC的作用進行初步探討。

1 材料和方法

1.1材料 人SCLC細胞株NCI-H446由中國科學(xué)院細胞庫引進。新生小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和lipofect2000購于美國invitrogen公司。pRNAT-U6.1/Neo購于上海閃晶生物公司，大小6.4 kb。攜帶有綠色熒光蛋白報告基因，其兩端分別帶有BamH I和EcoR I.酶切位點。菌株JM109、DH5α均購于大連寶生物公司。引物設(shè)計、合成以及測序由大連寶生物公司完成。SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2為RNA干擾序列，SATB1-siRNA-N為無意義干擾序列。

1.2siRNA載體構(gòu)建 將合成的SATB1基因的siRNA引物si-1正義鏈：5'-GATCCCCGGATTTGGAAGAGAGTGTCTTCAAGAGAGACACTCTCTTCCAAATCCTTTTTGGAAA- 3'；反義鏈：5'-AGCTTTTCCAAAAAGGATTTGGAAGAGAGTGTCTCTCTT GAAGACACTCTCTTCCAAATCCGGG-3'；si-2正義鏈：5'-GATCCCCGTCCACCTTGTCTTCTCTCTTCAAGAGAGAGAGAAGACAAG GTGGACTTTTTGGAA A-3'反義鏈：5'-AGCTTTTCCAAAAAGTCCACCTTGTCTTCTCTCTCTCTTGAAGAGAGAAGACAAGGTGGAC GGG-3'；si-N正義鏈：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGTAACATACCACAGATGGGGCTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'。退火并將退火產(chǎn)物與RNAi-Ready pSIREN-DNR載體4℃過夜充分連接。熱轉(zhuǎn)化至DH5α中，分別命名為SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2，SATB1-siRNA-N，涂布平板后，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性單菌落，進行擴增，檢測陽性克隆，并測序。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，NCI-H446細胞用胰酶消化，接種于6 孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細胞達到60%～70%融合時，準備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換為無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)孔1 000 μl。取lipofect2000 10 μl，按照轉(zhuǎn)染試劑∶DNA(μg)為10∶2 的比例加入構(gòu)建成功的載體DNA，混勻后室溫孵育30 min，加入到6孔板中培養(yǎng)，6 h后加入100 μl胎牛血清。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后檢測各項指標。

1.4Western印跡鑒定沉默效果 收取部分細胞，加入預(yù)冷裂解緩沖液，剪碎，超聲勻漿，低溫超速離心。吸取上清液，Lowry法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠90 V 電泳3 h 后轉(zhuǎn)印。洗膜后1%BSA封閉非特異性抗原2 h。緩沖液洗膜，與一抗(1∶250)4℃孵育過夜。洗膜后與堿性磷酸酶標記二抗(1∶200)室溫下孵育2 h。NBT/BCIP顯色，以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽性，終止顯色，漂洗并干燥后避光保存。

1.5細胞增殖能力的檢測(MTT法) 用0.25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后24 h的4組細胞(未轉(zhuǎn)染組、SATB1-siRNA-1組、SATB1-siRNA-2組及SATB1-siRNA-N組)，以含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液配置成單細胞懸液。以每孔2×103個細胞接種于96孔板中，每孔體積0.2 ml，每組細胞接種6個孔，并以培養(yǎng)液為空白對照，以接種后24、48、72、96 h為4個觀察時間點，共鋪4塊板。置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出其中一塊板，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl， 37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清后每孔加入150 μl DMSO，并震蕩10 min使MTT充分溶解。用490 nm波長的酶標儀，測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力的檢測 將轉(zhuǎn)染后24 h四組細胞進行如下操作：水化后的Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加含15%胎牛血清1640培養(yǎng)液500 μl，在小室內(nèi)加入200 μl腫瘤細胞懸液，細胞數(shù)為5×103，培養(yǎng)液為含2%胎牛血清1640培養(yǎng)液，每組重復(fù)6個樣本。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽小心擦去微孔膜上層細胞，HE溶液染色。在顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層的細胞數(shù)，每個樣本計數(shù)10個視野。

1.7流式細胞儀分析細胞凋亡 將轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2及SATB1-siRNA-N 48 h的NCI-H446細胞未轉(zhuǎn)染的NCI-H446細胞在孵育24 h后收集，70%冰乙醇固定1 h，冷PBS洗2次，計數(shù)約1×104個細胞，重懸于200 μl binding Buffer，10 μl PI(50 mg/ml)，輕輕混勻，室溫避光處放置15 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染結(jié)果判定 因構(gòu)建的siRNA載體含有綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2、 SATB1-siRNA-N后，熒光顯微鏡觀察細胞核膜及胞質(zhì)內(nèi)可見綠色的熒光(圖1,圖2)，未轉(zhuǎn)染組無熒光表達，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NCI-H446細胞。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后NCI-H446細胞略腫脹，部分細胞變圓，死亡，而轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2后細胞的數(shù)量明顯少于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA-1的NCI-H446細胞(×100)

2.2SATB1-siRNA對SATB1蛋白表達的影響 Western印跡檢測SATB1蛋白表達水平，可見 86 kD處一條特異條帶。凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描 SATB1現(xiàn)色條帶，轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組與轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組相比，SATB1蛋白表達量明顯下降(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA-1的NCI-H446細胞(×100)

1為空白對照組，2為轉(zhuǎn)染siRNA-1組，3為轉(zhuǎn)染siRNA-N組，4為轉(zhuǎn)染siRNA-2組

2.3轉(zhuǎn)染前后細胞增殖能力的改變 轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2的NCI-H446細胞的增殖(17.27±1.19和15.96±1.85)與轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細胞相比較明顯受到抑制(9.07±1.36和11.81±1.65)。但轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組細胞之間以及轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組細胞沒有顯著的區(qū)別。見表1。

表1 不同組細胞吸光度值±s，n=5)

2.4轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡改變 細胞凋亡率SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2轉(zhuǎn)染的細胞均顯著高于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細胞。

2.5轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力的檢測 轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組在膜上的細胞數(shù)量(47±4和39±7)明顯少于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細胞數(shù)量(78±3和75±6,P<0.05)。但轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細胞之間以及轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組細胞沒有顯著的區(qū)別(P>0.05)。

3 討 論

SCLC約占全部肺癌20%～25%，其惡性程度高、發(fā)展迅速、早期可有遠處廣泛的轉(zhuǎn)移。SCLC對放化療敏感，近期療效好，但90%以上的患者治療后出現(xiàn)耐藥進而導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而目前發(fā)現(xiàn)的與SCLC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因較為罕見〔10〕。尋找新的SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并確定其在SCLC中的作用，對于SCLC的診斷和治療均具有一定的意義。

SATB1是一種組織特異性表達的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白(MBP)，定位于3號染色體短臂2區(qū)3帶，全長763個氨基酸。早期研究顯示，SATB1參與胸腺細胞發(fā)育、T細胞的成熟和染色體高級結(jié)構(gòu)的形成。2008年，Han等在《Nature》上首次揭示了SATB1和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，Han等在對細胞株和乳腺癌樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)，SATB1表達水平與乳腺癌細胞的侵襲性密切相關(guān)〔4〕。在隨后的體外實驗中，Han等應(yīng)用了RNA干擾的方法來下調(diào)SATB1的表達，結(jié)果使高轉(zhuǎn)移性細胞株MDA-MB-231和BT549的侵襲力大大下降。相反異位SATB1表達卻使非侵襲性細胞株SKBR3獲得了侵襲力。這些都提示，SATB1是乳腺癌細胞獲得和維持侵襲力、乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。肝癌、直腸癌、胃癌等多種腫瘤細胞的研究同樣顯示SATB1的過度激活及表達可導(dǎo)致腫瘤細胞的無限生長，抑制凋亡〔9，11，12〕。

本研究結(jié)果提示SATB1可能會成為治療SCLC一個理想的目標基因。轉(zhuǎn)移是實體瘤發(fā)展的最終步驟，是癌癥患者死亡的最常見的原因。控制腫瘤細胞的侵襲和遷移，可以提高癌癥患者的存活率，而SATB1在腫瘤的浸潤和遷移過程中起著重要的作用，本研究結(jié)果與該方面其他腫瘤的研究基本相一致。本研究結(jié)果還表明，轉(zhuǎn)染SATB1的siRNA后，SCLC細胞的增殖能力明顯下降。關(guān)于SATB1影響SCLC的增殖和侵襲的機制為何? 該方面的研究相對較少，但乳腺癌方面的研究顯示，SATB1改變了涉及腫瘤發(fā)生的多個方面的1 000余個基因的表達。在與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因方面，SATB1上調(diào)了許多促轉(zhuǎn)移基因，包括在轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生中起作用的metastasin(S100A4)和VEGFB，降解細胞外基質(zhì)和促進腫瘤侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、3和9，刺激侵襲的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFB1)，以及血管發(fā)生和骨轉(zhuǎn)移的結(jié)締組織生長因子(CTGF)。相反，SATB1下調(diào)了轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1、KAI1(CD82)、KISS1和NME1(NM23)。SATB1這種核基質(zhì)結(jié)合蛋白擔(dān)任了基因組組織者的角色，它顯著地改變了乳腺癌細胞的基因表達譜，誘導(dǎo)其出現(xiàn)侵襲性表型，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。將進一步研究其在SCLC細胞的具體機制。

總之，本研究顯示SATB1可調(diào)節(jié)的SCLC細胞的增殖、侵襲和凋亡，這可能會為因SATB1異常而引起的SCLC以及其他癌癥提供重要線索。

4 參考文獻

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