腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β在淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病大鼠神經元損傷中的作用

邢恩鴻 田建麗 王愛霞 王瑞婷

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

淀粉樣蛋白(Aβ)作為阿爾茨海默病(AD)發病的始動因子已得到認可。炎癥反應在AD中的作用越來越受到關注。流行病學研究發現，長期服用非甾體抗炎藥(NSAIDs)的老年人AD發生率明顯降低。Leuchtenberger等〔1〕研究發現，給予NSAIDs后AD模型動物腦內Aβ沉積和活化態小膠質細胞的數量均明顯減少，腦內炎性反應明顯減輕。本實驗通過大鼠雙側海馬注射Aβ制作癡呆模型，采用免疫組化、ELISA等技術探討炎癥因子、膠質細胞在AD發生中的作用，為抗炎藥物用于AD的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 雄性Wistar大鼠20只，10～12 w,體質量(280±20)g,動物證號712123，由河北省實驗動物中心提供，清潔級。分籠飼養，每籠5只動物室溫度(22±2)℃，自然光線，自由食水，普通飼料，適應性喂養1 w，隨機分為對照組、實驗組，各10只，對照組大鼠海馬注射生理鹽水，模型組大鼠雙側海馬各注射Aβ 5 μl含10 μg,注射7 d后進行水迷宮實驗，連續測6 d，于第14天，處死，取血、腦組織。

1.2試劑 Aβ25～35購自Sigma公司，HPLC≥97%，1 mg溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L),-20℃保存，臨用前置于37℃孵育7 d成凝膠態。大鼠血清TNF-α(RRA00)，IL-1β(RTA00)ELISA試劑盒由R&D提供,山羊抗兔GFAP 多抗(G9269)購自中杉公司，其他試劑為分析純。

1.3癡呆動物模型制作 4%的水合氯醛腹腔麻醉(1 ml/100 g)大鼠，固定于大鼠腦立體定位儀，于大鼠AP -3.5 mm，ML ±2 mm，DV 2.7 mm定位海馬CA1區，微量注射器10 min內緩慢注入Aβ。

1.4Morris水迷宮行為學實驗 圓形不銹鋼水池，直徑120 cm,高60 cm，將水池等分為4個象限，目標象限的中央放置一直徑為10 cm，高23.5 cm的圓形隱藏平臺，每天將大鼠從4個象限點面向池壁各測驗2次，記錄動物尋找并爬上平臺所需時間，如果動物在60 s內未找到平臺，潛伏期記為60 s。第1～2天為訓練，后4 d數據作為學習、記憶成績。

1.5血清制備 每組取6只大鼠，麻醉后經心臟取血，室溫放置30 min，于4℃，4 000 r/min離心10 min,取上清，凍存于低溫冰箱。血清TNF-α、IL-1β檢測嚴格按試劑盒說明書進行。

1.6光鏡標本制作 每組選4只大鼠腦組織制作光鏡標本。動物麻醉取血后，經左心室快速灌注250 ml的生理鹽水，然后灌注含4%多聚甲醛的PB液250 ml進行內固定，1 h后取腦，在海馬注射部位沿冠狀面切開，在4%多聚甲醛中外固定過夜，PBS液沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，冠狀面連續切片，片厚5 μm，切片取含海馬部位，做硫堇染色和免疫組化研究。

1.7硫堇染尼氏體 切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，蒸餾水沖洗，0.2%硫堇60℃水浴30～60 min，冷卻后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.8免疫組化 用處理過的載玻片撈片，(75±5)℃烤片40 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，PBS洗，95℃水浴抗原修復10～15 min，PBS沖洗，3%甲醇-H2O2去除過氧化物，PBS洗，10%山羊血清封閉37℃ 15 min，滴加Ⅰ抗(GFAP1∶80)孵育37℃ 2.5 h，PBS洗，Ⅱ抗孵育37℃ 15 min，PBS洗，Ⅲ抗孵育37℃ 15 min，DAB顯色，終止顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用PBS液代替一抗為陰性對照。

1.9細胞計數 每組選取2個標本，光鏡下每個標本選海馬CA1區細胞損傷最嚴重的連續4張切片，400倍視野下計數CA1區損傷段的細胞數。

1.10統計學處理 采用SPSS11.5軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1Aβ對大鼠水迷宮實驗結果的影響 對照組大鼠第3、4、5、6天尋找平臺潛伏期呈現縮短趨勢，模型組大鼠尋找平臺潛伏期也呈現縮短趨勢，但潛伏期與對照組相比明顯延長(P<0.01，見表1)。

表1 Aβ對大鼠水迷宮實驗結果影響±s,s)

2.2Aβ對大鼠海馬神經元的影響 對照組海馬CA1區有3～4層細胞，排列整齊、形態清晰、結構完整，尼氏體呈紫色，核不著色，核仁清晰，居中，可見大量樹突；模型組大鼠海馬CA1區僅有1～2層細胞，排列不規整，局部出現大段神經元缺失、神經元缺失部分有大量膠質細胞浸潤，細胞形態異常，結構不完成，部分樹突斷裂。模型組大鼠海馬CA1區神經元數量明顯減少(P<0.01，見圖1，表2)。

2.3GFAP免疫組化染色結果 GFAP是膠質細胞特異性分泌的一種酸性蛋白，鏡下可見膠質細胞突起呈棕黃色(圖2)，模型組海馬GFAP陽性細胞數明顯高于對照組(見表2)。

A:對照組(×40);B:模型組(×100);C:對照組(×400);D:模型組(×400)

組別尼區染色GFAP陽性細胞對照組151.25±20.096.5±2.4模型組60.88±9.231)16.7±4.21)

對照組 模型組

2.4大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 模型組大鼠血清中TNF-α明顯高于對照組〔(86.72±25.37)pg/ml，P<0.05〕；大鼠血清中IL-1β〔(13.21±3.56)pg/ml〕明顯高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

體外凝聚態Aβ與AD患者腦中的Aβ有相似的結構，其中25～35位氨基酸序列的多肽片段是Aβ的生物活性片段〔2〕，有報道Aβ25～35體內外實驗研究顯示能引起海馬神經元損傷、學習、記憶能力下降〔3，4〕。

本實驗結果提示膠質細胞參與了Aβ引起的神經元損傷。有文獻報道膠質細胞可被Aβ激活，吞噬清除過多的Aβ，在中樞免疫過程是主要介體，其激活是AD發病的重要環節。GFAP在膠質細胞激活中表達增加，最后成為膠質疤痕的主要成分。GFAP特異性的存在于星形膠質細胞(Ast),研究發現GFAP的表達與Ast的活性成正比，GFAP表達增強標志中樞神經系統損害時反應性Ast增生〔5，6〕。

本實驗結果提示Aβ神經毒性作用通過Aβ激活膠質細胞分泌細胞因子，參與神經元損傷，促進Aβ沉積，加速病程的發展。AD患者腦內細胞因子水平持續增高,主要由處于持續激活狀態的膠質細胞(星形膠質細胞、小膠質細胞等)產生，主要包括TNF-α、IL-1β等的表達增加〔7〕。徐書雯等〔8〕研究發現補體C1q可能通過促炎性因子TNF-α增強Aβ誘導MG炎癥反應。鄔烈銘等〔9〕研究發現TNF-α濃度可能是反映癡呆嚴重程度的狀態指標。高濃度TNF-α對神經元具有毒性作用，Takeuchi等〔10〕研究發現TNF-α誘導神經毒性是通過激活的小膠質細胞(MG)自分泌谷氨酸鹽實現的。TNF-α與神經元膜上的受體TNF-R結合，而TNF-R與神經營養素受體具有同源性，能激活相似的信號轉導系統，引起TNF-α與神經營養素的相互競爭，誘導神經元凋亡。TNF-α可協同IL-1強烈誘導IL-6產生，加速Aβ沉積。有研究發現在AD患者腦中，IL-1β濃度增高與MG活化密切相關，MG在Aβ作用下可分泌大量的IL-1β〔11〕。IL-1β的過度表達誘導神經細胞凋亡〔12〕，促進Aβ沉積，加速AD的惡化。宴燕等〔13〕研究發現AD患者血清TNF-α、IL-1β顯著高于正常對照組，TNF-α、IL-1β水平的檢測可以成為臨床輔助診斷的生物學指標。最近有研究發現替米沙坦可以抑制炎癥反應，降低腦脊液內致炎細胞因子水平，減少對神經元的損害，改善認知功能〔14〕。

慢性激活狀態的膠質細胞所產生的細胞因子在AD發病的不同環節主要起放大炎癥過程和細胞毒性作用。細胞因子可興奮神經元，抑制膽堿能神經元傳遞，通過慢性局部炎癥導致選擇性腦區膽堿能神經元的變性死亡。因此，AD患者通過抗炎藥物抑制腦內炎癥反應的不適當激活，減少腦內細胞因子的量，可能延緩病程的發展。

4 參考文獻

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8徐書雯，張霞輝，李東風，等.補體C1q對Aβ纖維誘導的小膠質細胞炎性反應的影響〔J〕.中華老年醫學雜志，2013;32(1)：96-8.

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10Takeuchi H,Jin S,Wang J,etal.Tumor necrosis factor-alpha induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner〔J〕.J Biol Chem,2006;281(30):21362-8.

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14Washida K,Ihara M,Nishio K,etal.Nonhypotensive dose of telmisartan attenuates cognitive impairment partially due to peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activation in mice with chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.Stroke,2010;41(8):1798-806.