高血糖對全腦缺血再灌注大鼠學習記憶的影響及PD98059的干預作用

李建民 趙雅寧 常學優 劉 樂

(河北聯合大學康復醫學院，河北 唐山 063000)

研究發現高血糖不僅是腦梗死的最常見病因，同時，高血糖又增加了腦梗死的危險性，加重腦缺血病理損傷，影響預后〔1〕。PD98059是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員-細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2) 特異性抑制劑。MAPKs信號通路是連接大多數細胞外信號與膜受體、轉錄因子和各基因調節的中央信號通路，其家族成員包括細胞外信號調節激酶(ERK)和p38 MAPK等。研究認為ERK1/2信號激活后通過鏈式級聯反應，激活轉錄因子ATF-2、Elk-1、CHOP10等，調控細胞因子，凋亡基因的表達，對中樞神經系的影響主要表現“雙刃劍”作用〔2，3〕。本研究建立高血糖大鼠全腦缺血再灌注損傷模型上，應用PD98059進行干預，觀察海馬區神經細胞形態結構、學習記憶功能的變化，以探討PD98059對高血糖大鼠腦缺血再灌注損傷后認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠120只，由北京維通利華公司提供，體重250～300 g，實驗動物使用許可證編號：SCXK(京)2005-0013。

1.2實驗儀器與試劑 圖像采集及圖像分析系統(美國Bio-Rad生物儀器設備公司)；八臂迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司)；血糖儀(拜耳儀器設備有限公司)。

1.3實驗方法 大鼠隨機分為4組：假手術組(Sham，n=10)、全腦缺血再灌注組(IR，n=20)、高血糖+全腦缺血再灌注組(DCI，n=20)、高血糖+全腦缺血再灌注+PD98059抑制劑組(PD，n=20)。每組又隨機分為24 h、48 h兩個時間點。采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔3〕制作SD大鼠全腦缺血模型：動物常規麻醉，頸正中切口,分離雙側頸總動脈,在其下置線備用。枕后部正中切開,暴露雙側第1頸椎橫突翼孔,直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4 s，使翼小孔后雙側椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血30 min后松開動脈夾，實行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監測耳內鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。Sham組分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。DCI模型：大鼠術前禁食12 h，按55 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后空腹血糖超過16.7 mmol/L，有多尿、體質量下降等表現的大鼠為高血糖大鼠后，按照上述IR模型進行手術，方法同IR組。PD抑制劑組：高血糖大鼠復制成功后，在夾畢雙側頸總動脈前2 h經尾靜脈注射配制好的PD98059(0.3 mg/kg)其余手術方法同IR組。

1.4病理組織學檢測 HE染色： 0.4 % 戊巴比妥鈉麻醉動物，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1 mm和6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，蘇木精-伊紅染色。電鏡：動物常規麻醉，混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，取海馬，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 組織塊，立即以4 %戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，再經1%四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級丙酮脫水,環氧樹脂浸透,包埋,超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色。透射電鏡觀察腦組織超微結構的變化。

1.5學習記憶功能檢測 八臂迷宮是一種比較理想的測試學習和記憶的模型，實驗動物通過觀察周圍一些固定的參照物所提供的信息，來學習和記憶自身與餌(置于迷宮臂末端的食物)的相對位置。該方法不但可以有效地排除動物由于自身運動機能障礙而對學習和記憶觀察指標的影響，還可以同時分離和分析動物工作記憶與參照記憶〔4〕。各組實驗動物在晚8:00和早6：00分2次進入八臂迷宮進行學習和記憶行為功能檢測，每天每只動物測試兩次，取均值。將大鼠放入迷宮內，記數大鼠5 min內搜索放置在八臂中的四個臂內(1、3、5、7號臂)食物餌的規律：①總錯誤次數(TTEF)，即大鼠進入沒有餌的臂(包括已吃完和未放餌的臂)的次數；②工作記憶錯誤次數(TWMEF)，工作記憶錯誤是指大鼠再次進入開始放有餌的臂的次數；③參考記憶錯誤次數(TRMEF)，參考記憶錯誤是指大鼠第1次進入沒有放餌的臂的次數。

1.6統計學方法 應用SPSS統計軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1病理檢測結果 HE染色(表1)：Sham組海馬區神經元結構完整，排列整齊致密，未見變性壞死的神經元。IR組24和48 h時間點均可見海馬區變性壞死神經元，表現為細胞間隙加大，細胞核濃縮、深染，溶解、消失，存活神經元密度均明顯減少(P<0.05)；DCI組中海馬區神經元結構損傷加重，神經元細胞存活密度進一步降低(P<0.05)；PD組海馬區存活的神經元較進一步減少，視野內較少正常的神經細胞(P<0.05)。電鏡(圖1，圖2)：Sham組中神經元內可見正常細胞器,包括高爾基體、粗面內質網、多聚核糖體、線粒體、溶酶體等。神經細胞軸索、微管正常；軸索結構排列正常。IR組24和48 h時間點可見神經細胞不同程度固縮，胞質、胞核電子密度增高,核膜凹陷,高爾基體擴張呈大泡狀,多聚核糖體解聚，高度腫脹、線粒體嵴斷裂或空泡化，雙膜結構模糊或外膜破裂、消失，細胞器稀疏；軸索排列紊亂、腫脹，髓鞘泡鼓、內折及分層，軸索變性、斷裂等。DCI組中神經元細胞損傷進一步加重，染色質聚集明顯，基質出現大量空泡，核膜模糊、凹陷，細胞器數量減少，僅見極少量細胞器，髓鞘嚴重分層，一些部位出現斷裂。PD組各時間點神經元損傷現象進一步加重，視野內較少超微結構正常的神經細胞。

表1 各組大鼠海馬區存活神經元密度比較±s,n=20)

圖1 各組大鼠缺血48 h海馬區神經元形態變化(×20 000)

圖2 各組大鼠缺血48 h海馬區髓鞘的形態變化(×20 000)

2.2學習記憶功能檢測結果 與Sham組比較，IR組動物8次測試中總錯誤次數和參考錯誤次數增加(P<0.05)，與IR組比較，DCI組中大鼠總錯誤次數、參考錯誤次數和工作記憶次數增加(P<0.05)；與DCI組比較，PD組中總錯誤次數和參考記憶錯誤次數進一步增多(P<0.05)，但工作記憶錯誤次數無明顯變化(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠學習記憶功能指標檢測結果比較±s,n=20)

3 討 論

本實驗結果說明高血糖可加重腦缺血的病理損傷及神經功能的預后。與臨床相關報道一致。研究認為高血糖加重缺血性腦損傷的機制與加劇對血腦屏障的破壞、惡化炎癥反應、增加細胞凋亡等從而加重腦缺血再灌注損傷有關〔5，6〕。

PD98059是ERK1/2蛋白特異性抑制劑，可抑制ERK1/2/MAMPK信號通路的激活，該信號的特點是應激激活后通過鏈式級聯反應，激活轉錄因子ATF-2、Elk-1、CHOP10等，調控細胞因子，凋亡基因的表達，參與多種病理和生理過程。目前關于ERK1/2信號通路在中樞神經系統疾病中的病理作用存有一定爭議。有學者認為ERK1/2通過介導某些生長因子轉錄如ELK-1、c-fos、c-myc等，促進細胞的增殖、分化，影響突觸重塑，抑制死亡、促進細胞存活而對神經損傷后的形態和功能有保護作用〔7〕。也有觀點認為ERK1/2信號可強化谷氨酸興奮性毒性作用、擴大炎癥及氧化應激反應、介導神經細胞凋亡從而加重腦缺血、癲癇、PD等病理損傷。海馬是大腦的重要結構,在學習和記憶功能以及調節神經內分泌和自主神經活動中起重要作用〔8，9〕。動物實驗顯示,損毀雙側海馬可妨礙動物視覺分辨學習,使大鼠Y迷宮分辨學習和防御條件反應的保持遭到嚴重的破壞〔10〕。本研究說明PD98059進一步加劇了高血糖對腦缺血動物的神經損傷，也提示ERK1/2作為內源性啟動的保護性蛋白參與高血糖加重腦缺血損傷病理進程。本研究中，與DCI組比較，PD組中海馬區存活神經元密度進一步下降。結合文獻，我們認為PD98059干擾ERK1/2信號通路的活化，抑制ERK1/2的促細胞存活信號的轉錄，促進海馬區神經細胞的死亡，進而加重了高血糖腦缺血動物的學習記憶損傷。

4 參考文獻

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