調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病患者肺功能降低中的作用

王成陽(yáng) 劉向國(guó) 彭青和 李 達(dá) 季喬雪 王傳博 李澤庚

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽 合肥 230022)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)病因可能與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)〔1〕，病人存在免疫功能紊亂〔2〕。近期一些免疫學(xué)研究認(rèn)為，感染、炎癥的不斷刺激、免疫功能紊亂等各種因素相互作用〔3〕，大量細(xì)胞因子和趨化因子等破壞了自身免疫耐受〔4〕，并刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，如輔助T細(xì)胞(Th)，特別是Th1，Th2，Th17等，在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)缺陷的背景下導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和B 淋巴細(xì)胞活化，導(dǎo)致咳嗽、氣喘或肺功能降低等癥狀。前期研究發(fā)現(xiàn)，COPD氣道巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等均參與了炎癥、免疫反應(yīng)和肺功能降低的過(guò)程。本文擬進(jìn)一步觀察COPD患者Th1型、Th2型、Th17型細(xì)胞因子及Treg的變化，探討Treg、Th細(xì)胞在COPD肺功能降低的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1對(duì)象 選取2012年5月至2013年5月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科收住的COPD患者60例，男42例，女18例，年齡36～76〔平均(58.4±15.73)〕歲，病程3～21年，平均(13.7±5.58)年。另選取健康對(duì)照者(正常組)40例，男26例，女14例，年齡40～70〔平均(55.8±19.29)〕歲。兩組基線比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2主要試劑和設(shè)備 γ-干擾素(IFN-γ)、白介素(IL)-4、IL-17試劑盒購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：35681H、37584H、30396H；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD25單抗，藻紅蛋白(PE)-花青染料(Cys)5標(biāo)記的抗CD4單抗，PE標(biāo)記的抗FOXP3單抗均購(gòu)自美國(guó)eBioseience，sanDiego，CA。肺功能儀購(gòu)自日本捷斯特公司，型號(hào)Chest-25F；酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO-RAD公司，型號(hào)：iMARK；離心機(jī)購(gòu)自eppendorf公司，型號(hào)：Centrifuge 5417R；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，型號(hào)：EPICS。

1.3受試標(biāo)準(zhǔn) 參照2010年慢性阻塞性肺疾病全球倡議和2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性阻塞性肺疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡30～80歲；③自愿接受臨床研究，簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由結(jié)核、支擴(kuò)、囊性肺纖維化、真菌、腫瘤、矽肺、刺激性氣體、過(guò)敏因素所致的慢性咳嗽喘息患者；②合并氣胸、肺大泡者及有出血傾向者；③影響呼吸運(yùn)動(dòng)功能的神經(jīng)肌肉疾??；④其他疾病如心血管、泌尿、消化、造血、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等嚴(yán)重并發(fā)病，肝、腎功能不全，神志不清、癡呆及各種精神病患者；⑤ 妊娠或哺乳期婦女。停止臨床研究標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重不良事件或不良反應(yīng)，不能繼續(xù)受試者；②不能堅(jiān)持的受試者，經(jīng)勸說(shuō)無(wú)效；③沒(méi)有嚴(yán)格按照方案進(jìn)行的受試者；④中途失去聯(lián)系的受試者。本試驗(yàn)遵循赫爾辛基宣言和中國(guó)有關(guān)臨床試驗(yàn)研究的法規(guī)〔6，7〕，臨床試驗(yàn)方案經(jīng)研究負(fù)責(zé)單位安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，每位受試者入選前均簽署知情同意書。

1.4肺功能測(cè)定 測(cè)試時(shí)間安排在上午進(jìn)行。使用200 μg沙丁胺醇15 min后，測(cè)定肺功能參數(shù)：第1秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC、最大呼氣流量(PEF)。各指標(biāo)均以實(shí)測(cè)值占預(yù)計(jì)值百分比表示，>80%為正常。

1.56 min步行試驗(yàn)(6MWT) 在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的走廊內(nèi)進(jìn)行，走廊長(zhǎng)30 m，讓患者在走廊盡可能地來(lái)回行走，記錄患者6 min能行走的最遠(yuǎn)距離。若患者在行走過(guò)程中出現(xiàn)頭暈、暈厥或心絞痛等相關(guān)癥狀，應(yīng)立即終止。

1.6血清細(xì)胞因子檢測(cè) 包括IFN-γ、IL-4、IL-17，采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具體實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)ELISA試劑盒操作步驟。

1.7外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg檢測(cè) 調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液細(xì)胞密度為1×106/ml，取流式管分別標(biāo)記為COPD組、健康對(duì)照組和同型對(duì)照組，每管各加入100 μl制備的細(xì)胞懸液，每管加入20 μl的CD4、CD25混合抗體，暗處孵育30 min，用破膜緩沖液2 ml洗滌細(xì)胞，離心(2 000 r/min，5 min)，棄上清，控干；每管中加入1 ml新鮮配制的固定破膜劑工作液，用移液器吸打混勻，避光孵育60 min，用2 ml破膜緩沖液洗細(xì)胞2次，離心去上清，留大約100 μl液體重懸細(xì)胞，每管加入2 μl的血清封閉，避光孵育15 min；約留100 μl液體重懸細(xì)胞，加入5 μl的FOXP3抗體，同型對(duì)照管中加入同型對(duì)照，避光孵育至少30 min；用2 ml的透化緩沖液洗2次，離心去上清；用300 μl染色緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8觀察指標(biāo) 一般體格檢查：身高、體重、呼吸、心率、血壓；安全性檢測(cè)：血常規(guī)、尿、糞常規(guī)、肝腎功能、心電圖、胸片。

2 結(jié) 果

2.1COPD患者肺功能及6MWT 與正常組比較，COPD患者FEV1、FVC、PEF、FEV1/FVC降低(P<0.05或P<0.01)，6MWT降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2COPD患者血清IFN-γ、IL-4、IL-17及外周血Treg變化 COPD患者血清IFN-γ、IL-17及Th1/Th2較正常組升高，而IL-4降低(P<0.05或P<0.01)。同時(shí)，COPD患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg表達(dá)較正常組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 COPD患者肺功能、6MWT、血清IFN-γ、IL-4、IL-17及外周血Treg變化比較±s)

2.3COPD患者Treg、Th細(xì)胞與肺功能之間的關(guān)系 相關(guān)分析結(jié)果顯示，COPD患者Treg與IL-17呈負(fù)相關(guān)(r=-0.528,P<0.01)，IL-17、IFN-γ與IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.379、-0.408,P<0.05)；Treg與IL-4呈正相關(guān)(r=0.387,P<0.05)，IFN-γ與Th1/Th2、IL-17呈正相關(guān)(r=0.415、0.395,P<0.05)。PEF與IL-17呈負(fù)相關(guān)(r=-0.452,P<0.05)，F(xiàn)EV1/FVC與IFN-γ、Th1/Th2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.473、-0.452,P<0.05)；FEV1與IL-4、Treg呈正相關(guān)(r=0.393、0.436,P<0.05)，F(xiàn)EV1/FVC與Treg 呈正相關(guān)(r=0.427,P<0.05)。

3 討 論

COPD是由多種炎性細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)性慢性炎癥，不僅累及呼吸系統(tǒng)，而且涉及全身各器官和系統(tǒng)，影響機(jī)體整個(gè)生理、病理過(guò)程。免疫功能紊亂特別是T淋巴細(xì)胞的分泌和表達(dá)失衡可直接導(dǎo)致COPD的發(fā)生。T淋巴細(xì)胞中尤其與CD4+CD25+FOXP3+Treg和Th細(xì)胞的表達(dá)關(guān)系密切，CD4+CD25+Treg是一類在胸腺發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的天然性Treg，Treg在COPD疾病中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用〔8，9〕。在T細(xì)胞整體水平上，Th細(xì)胞在身體內(nèi)處于平衡時(shí)，使機(jī)體行使生理防御、自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視的重要免疫功能；而當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài)時(shí)，Th平衡被破壞，引起Th1/Th2失衡或Th17細(xì)胞過(guò)表達(dá)，引起COPD發(fā)生。

CD4+CD25+Treg 細(xì)胞具有明顯抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖的能力，消除CD4+CD25+Treg細(xì)胞可引起嚴(yán)重的器官特異性自身免疫性疾病，重建后能阻止自身免疫性疾病的發(fā)展〔10〕。FOXP3是CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)志，以FOXP3作為研究的標(biāo)記能更加準(zhǔn)確地反映Treg的比例。FOXP3的表達(dá)在CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育和分化中起著關(guān)鍵作用〔11，12〕。本研究提示COPD 患者存在免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，且CD4+分泌的IFN-γ、IL-17均顯著高于正常組，而IL-4表達(dá)水平降低。而且CD4+CD25+FOXP3+Treg 可能通過(guò)Th1、Th2、Th17協(xié)同參與COPD 發(fā)生發(fā)展過(guò)程。CD4+CD25+FOXP3+Treg免疫抑制功能明顯下降，從而失去對(duì)炎性細(xì)胞因子特別是Th1和Th17細(xì)胞的抑制，導(dǎo)致IFN-γ、IL-17水平升高，IL-4表達(dá)降低，Th1/Th2比例失衡，從而出現(xiàn)免疫應(yīng)答持續(xù)處于過(guò)高的狀態(tài)，造成對(duì)自身組織如氣道、肺組織等的損害，從而出現(xiàn)肺功能降低、咳嗽、氣喘等。

Th17細(xì)胞與Treg在許多組織中均同時(shí)存在，Treg具有抗炎性反應(yīng)和維持自身免疫耐受的功能，二者的動(dòng)態(tài)平衡可能與機(jī)體發(fā)生適當(dāng)強(qiáng)度的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。Th17細(xì)胞和Th細(xì)胞在發(fā)育上可能具有密切聯(lián)系〔13，14〕。Th細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞群，可分為Th1和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞稱為炎癥性T細(xì)胞，主要分泌IFN-γ、IL-2等，參與介導(dǎo)與細(xì)胞毒和炎癥反應(yīng)有關(guān)的免疫應(yīng)答，同時(shí)參與遲發(fā)性超敏性炎癥形成。Th2細(xì)胞與體液免疫相關(guān)，主要分泌IL-4、IL-10等，刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體IgM、IgG2a和IgA等。Th1細(xì)胞持續(xù)性強(qiáng)應(yīng)答可能與COPD發(fā)病有關(guān)〔15〕。IFN-γ可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，但抑制Th2細(xì)胞如IL-4增殖；同時(shí)，IL-4誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化，抑制Th1細(xì)胞功能〔16〕。Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞共同介導(dǎo)COPD免疫病理現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)〔17〕，僅有Th17細(xì)胞的參與并不能誘導(dǎo)COPD的發(fā)生，必須要有Th1細(xì)胞參與。因此，Th17細(xì)胞可能是通過(guò)招募Th1細(xì)胞，或者向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)COPD炎癥反應(yīng)增加。當(dāng)COPD急性炎癥期時(shí)，具有強(qiáng)烈組織損傷能力的Th17細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17，引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的急性炎癥。隨著COPD炎癥進(jìn)展，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^輕組織損傷能力的Th1細(xì)胞應(yīng)答，IFN-γ引起的單核細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)，從而共同作用導(dǎo)致COPD。

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