DNMT3B啟動(dòng)子區(qū)SNP(-579G/T)與佳木斯肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

張淑紅 王茉琳 戚家峰 劉 爽 楊欣艷 張 虎

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

肺癌是發(fā)病與多種因素如吸煙、遺傳、癌基因的激活及抑癌基因的失活等相關(guān)，關(guān)于肺癌的病因?qū)W、預(yù)防、診斷、治療等研究已經(jīng)成為研究領(lǐng)域的重要課題〔1〕。已有研究表明遺傳因素在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療反應(yīng)、預(yù)后等環(huán)節(jié)中具有重要的作用，因此開展肺癌的遺傳研究對(duì)于肺癌易感人群的篩查、治療方法的選擇、預(yù)后判斷等都具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(SNP)應(yīng)用于肺癌的關(guān)聯(lián)研究，是肺癌研究領(lǐng)域中較為活躍的內(nèi)容之一〔2〕。已有文獻(xiàn)表明，肺癌易感性與某些SNP位點(diǎn)有相關(guān)性〔3〕。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)介導(dǎo)的，DNMT3A與DNMT3B 的功能是產(chǎn)生新的甲基化型。在腫瘤中，啟動(dòng)子CpG島高甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)改變，在人類各種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，并和異常的基因轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)〔4〕。SNP、DNA甲基化與腫瘤三者之間的關(guān)系就已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道〔5〕。本研究旨在探討DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)SNP-579G/T位點(diǎn)與肺癌發(fā)病易感性之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1材料 病例組選自佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院、佳木斯市腫瘤醫(yī)院的肺癌血液樣本98例，男68例，女30例，年齡53～70(平均61.0)歲病例的臨床資料完整。血液標(biāo)本采集前均沒有抗腫瘤藥物的使用記錄。對(duì)照組為健康人血液樣本105例，男60例，女45例，年齡55.0～64.0(平均69.5)歲。其中性別、年齡等與病例組相匹配，見表1。兩組人群都是佳木斯地區(qū)漢族人群，個(gè)體之間均無血緣關(guān)系(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1全基因組DNA抽提 采集靜脈全血2 ml，運(yùn)用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，分別提取肺癌患者、健康對(duì)照組外周血，提取的DNA溶解于pH8.0 的TE中，4 ℃保存。

1.2.2PCR 引物序列如下：上游5′CAGGTCTCATTATGCCTAGG-3′(nt 1533753-1533772)，下游5′GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3′(1533977-1533958)，擴(kuò)增產(chǎn)物225 bp。單管反應(yīng)體系25 μl包含dNTPs 0.1 mmol/L，上下游引物各10 pmol，Taq DNA聚合酶1.25 U，DNA 1.0 μl(100 ng)。95 ℃預(yù)變性5 min；95℃ 20 s，56℃20 s，72℃20 s共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈下觀察。

1.2.3限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切反應(yīng) 20 μl酶切反應(yīng)體系含10×緩沖液2.0 μl，pvuⅡ(TaKaRa公司)4 U，PCR產(chǎn)物2.0 μl，混勻后37℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。選擇凝膠電泳證實(shí)為 GT基因型，經(jīng)雙脫氧終止法測序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DNA電泳 采集研究對(duì)象EDTA抗凝的外周血，運(yùn)用基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，部分結(jié)果如圖1所示。

2.2PCR-RFLP分析DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)(-579G/T) PCR產(chǎn)物225 bp，Marker為puc19，其片段大小由上至下依次為：501、403、331、242、190、147、110 bp。如圖2所示。經(jīng)限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切，酶切產(chǎn)物為132 bp和93 bp，部分結(jié)果如圖3所示。-579G/T位點(diǎn)PCR-RFLP分型結(jié)果經(jīng)測序驗(yàn)證，利用BLAST與基因DNMT3B全序列(GeneID：1789 NC000020.9)進(jìn)行比對(duì)，如圖4，圖5。

2.3-579G/T位點(diǎn)基因頻率分布 -579G/T位點(diǎn)在肺癌病例組和正常對(duì)照組中基因型分布無顯著差異(P>0.05)，見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證兩個(gè)群體均為遺傳平衡群體。-579G/T位點(diǎn)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.991 3，OR(95%CI)=1.003 6(0.521 6～1.931 0)〕。

圖1 部分模版DNA提取電泳圖

1～3:PCR產(chǎn)物

表1 DNMT3B(-579G/T)基因型和基因頻率分布〔n(%)〕

3、5、7：雜合子GT，其余泳道為純合子TT

圖4 GT雜合子測序圖

圖5 TT純合子測序圖

3 討 論

SNP是指DNA多態(tài)性在人群中的分布頻率大于1%的可遺傳性的變異。研究表明，位于基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP能影響基因的表達(dá)或酶的活性〔6〕。本研究所得DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-579G/T該位點(diǎn)與佳木斯地區(qū)肺癌的易感性無顯著相關(guān)性，且兩組中均為檢出GG基因型個(gè)體。

DNMT3B基因的SNP位點(diǎn)與疾病的關(guān)聯(lián)研究已見報(bào)道，目前集中在某單個(gè)的位點(diǎn)及某些單體型的研究，且各個(gè)位點(diǎn)在人群中基因型的分布及SNP位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性具有民族性、區(qū)域性的差異。文獻(xiàn)報(bào)道表明DNMT3B啟動(dòng)子區(qū) C46359T的CT+TT基因型所患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)幾乎是CC基因型的2倍〔7〕；Hu等〔8〕采用PCR-RFLP 和DNA 測序的方法，對(duì)259例胃癌患者和262位健康對(duì)照人群的DNMT3B啟動(dòng)子區(qū)SNP-149C/T 和-579G/ T位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，-579G/ T 位點(diǎn)與胃癌易感性相關(guān)，攜帶G 等位基因的個(gè)體較TT 基因型個(gè)體患胃癌的易感性低，且該位點(diǎn)基因型在中國人、韓國人和美國人中的分布不同。由此可說明，基因多態(tài)性因人群、種族以及地域分布的不同而存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同人群對(duì)腫瘤易感性的差異。Srivastava等〔9〕研究表明DNMT3B啟動(dòng)子-579G/ T位點(diǎn)與印度北部地區(qū)膽囊癌的易感性無顯著相關(guān)性。

與肺癌發(fā)病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)已有文獻(xiàn)報(bào)道，例如Wang等〔10〕首次研究了CYP2A13常見多態(tài)性位點(diǎn)rs8192789(Arg257Cys)與中國漢族人群的肺癌易感性，研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與肺腺癌具有相關(guān)性，CT+TT基因型較CC基因型降低了腺癌的易感性。之后法國的研究者〔11〕研究了高加索人群另一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(Arg101Stop)與肺癌易感性的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與小細(xì)胞肺癌具有相關(guān)性。D'Agostino等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)CT或TT基因型(Arg257Cys)的CYP2A13明顯降低了對(duì)煙草前致癌物的代謝，與Wang的研究結(jié)果是一致的。Zhang等〔13〕研究了p53常見多態(tài)性位點(diǎn)rs1042522、Arg72Pro與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高加索人群中攜帶Pro72Pro基因型的個(gè)體的肺癌的易感性增加。Mechanic等〔14〕從單體型水平上研究了高加索人群和非洲人群中p53基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系，他在對(duì)p53基因進(jìn)行整體分析的基礎(chǔ)上選擇了16個(gè)常見SNP，包括標(biāo)簽SNP(tagger SNP)和功能性SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895、rs12951053在非洲人群中與肺癌易感性以及預(yù)后有關(guān)聯(lián)，而由rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895組成的一個(gè)單體型OR值達(dá)到2倍以上。Sauter等〔15〕的研究也發(fā)現(xiàn)了在高加索人群中MMP1的常見多態(tài)性與肺癌的發(fā)生具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中表明，DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-149C/T與本地區(qū)肺癌的發(fā)生無相關(guān)性〔16〕。

總之，關(guān)于SNP與肺癌易感性的研究已經(jīng)成為肺癌遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)，大量的研究發(fā)現(xiàn)了可能與肺癌發(fā)生具有關(guān)聯(lián)的易感性SNP，這些有關(guān)聯(lián)的SNP理論上有望成為篩選肺癌易感人群的分子標(biāo)志物。從基因多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系著手研究，可以從基因的水平解讀種族間肺癌易感性的差別，為易感者的篩選，肺癌早期診斷提供遺傳標(biāo)記。研究這種不同個(gè)體間基因的差異對(duì)于肺癌的臨床個(gè)體化治療的實(shí)施具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室在研究DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-149C/T位點(diǎn)的基礎(chǔ)上繼續(xù)研究-579G/T位點(diǎn)，也是對(duì)DNMT3B基因的SNP-579G/T多態(tài)性在佳木斯地區(qū)基因型分布及其與肺癌發(fā)生關(guān)系的初步探索，由于樣本量不大，再加上有些基因型在人群中的分布比例較小，所以不能完全確定DNMT3B基因-579G/T多態(tài)性與肺癌易感性無關(guān)。可在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)加大樣本進(jìn)行按吸煙、病情分期、分層來探討兩者間的關(guān)系，同時(shí)需要做SNP單體型的研究。至于該基因的SNP位點(diǎn)與其他腫瘤易感性的關(guān)系，尚需進(jìn)行更深入的研究，加以闡明。

SNP將幫助人們認(rèn)識(shí)復(fù)雜的多基因疾病，如癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病〔17〕，影響這些疾病的基因很難用傳統(tǒng)方法確定。而SNP和藥物或疾病的易感性相關(guān)，使其能在攻克癌癥方面有所作為，這對(duì)腫瘤藥物的開發(fā)和分子靶向治療都有很大的促進(jìn)作用。隨著對(duì)表觀遺傳與遺傳變異研究的不斷深入，SNP將為腫瘤易感性預(yù)測、預(yù)防及治療帶來新啟示。

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