Heregulin和VEGF在結腸癌組織中的表達及其臨床意義

周 青 王冬芽 劉 星

(井岡山大學醫學院重點實驗室，江西 吉安 343009)

結腸癌是一種高發的惡性腫瘤〔1〕，而惡性腫瘤的發生、發展是一個涉及多基因的分子水平變化的多階段過程〔2〕。文獻認為〔3〕血管內皮生長因子(VEGF) 是病理性血管生成最主要的刺激因子，其在多種惡性腫瘤的生長及轉移中發揮著重要作用。研究還表明〔4～6〕，許多腫瘤中VEGF受上游因子調節而過表達，進而誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤生長浸潤。Neurcgulins(簡稱NRG)是一個和表皮生長因子(EGF)相關的生長和分化因子家族〔7〕。近來研究顯示〔8～12〕，Heregulin在多種癌癥中與EGF受體家族成員HERs結合，再激活一系列的下游信號分子促進癌細胞增殖浸潤。但是，在惡性腫瘤發生發展中Heregulin與VEGF的關系及其意義目前仍少見報道。本研究中，筆者采用Western印跡檢測Heregulin、VEGF在結腸癌組織、癌旁組織及遠癌正常組織的蛋白表達， 采用RT-PCR檢測VEGF在結腸癌組織、癌旁組織及遠癌正常組織的基因表達，并探討二者在結腸癌發生發展中的可能關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取在井岡山大學附屬醫院就診的結腸癌根治術患者術后的新鮮腸癌組織標本為研究對象，分組如下：(1)結腸癌組：10例，男5例，女5例，年齡33～81歲，中位年齡61歲。同時收集患者的臨床資料，包括腫瘤發生部位、組織學分型、分化程度、Dukes分期、有無淋巴結轉移等。(2)癌旁組織組：10例，取上述結腸癌組患者毗鄰腫瘤旁的腸黏膜組織。(3)遠癌正常組織組：10例，取上述結腸癌組患者腫瘤旁10 cm以外的腸組織。癌旁組織組及遠癌正常組織組均經蘇木素-伊紅(HE)染色病理證實無腫瘤浸潤。

1.2Western印跡 取樣品與5倍上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進行SDS- PAGE電泳；電泳后以穩定18 V電壓， 半干法電轉移至PVDF 膜， 用含5%脫脂奶粉TBS/T 緩沖液封閉1 h，加入一抗， 4℃過夜， 洗膜， 加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h， 暗室中ECL發光液覆蓋膜5 min， X 光膠片曝光，顯影，定影，PVDF膜上特異性條帶經Olympus BX41凝膠成像儀掃描進行相對定量。所用試劑購自美國Sigma公司及武漢博士德公司。

1.3RT-PCR 按EZ Spin Column RNA Purification Kit說明提取總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9～2.0。以提取的RNA為模板逆轉錄合成cDNA。反應結束后取出cDNA按1∶1稀釋，4℃保存。用于RT-PCR的引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中VEGF的引物序列為：正義：CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG，反義：TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC。β-actin的引物序列為：正義:ACCACCATGTACCCAGGCAT，反義：CCGGACTCATCGTACTCCTG。經由40個循環的變性、退火和延伸，生成的PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描分析，結果用靶基因/β-actin比值表示。RNA純化試劑盒、SYBR green 染料、MuLV逆轉錄酶、RNase、Trizol、dNTP、TaqDNA聚合酶等均購自美國Applied Biosystems 公司。

1.4統計學分析 采用SPSS13.0軟件。組間比較采用χ2分析或t檢驗。

2 結 果

2.1Heregulin、VEGF蛋白在各組的表達 圖1可見，Heregulin和VEGF在結腸癌組織組的蛋白表達率高于癌旁組織組及遠癌正常組織組(P<0.05)，VEGF mRNA表達及蛋白表達呈顯著正相關，前者表達較高的標本，后者表達也高。

1.結腸癌組；2.癌旁組織組；3.遠癌正常組織組

2.2VEGF mRNA在各組的表達 VEGF在結腸癌組織組的mRNA表達顯著高于癌旁組織及遠癌正常組織(P<0.05)，見圖2。結腸癌組織中Heregulin與VEGF蛋白表達呈正相關。

1.結腸癌組；2.癌旁組織組；3.遠癌正常組織組

3 討 論

Heregulin分子量為45 kD，為表皮生長因子家族(EGF家族)的分支〔13〕，具有EGF樣結構，是Holmes等〔7〕于1992年在生長人乳腺癌細胞MDA-MB-231的培養基中首先分離得到。近年來有資料報道〔8〕，Heregulin與HERs受體結合后可特異性激活下游信號分子或信號通路介導參與各種癌癥尤其是乳腺癌的浸潤和侵襲。有文獻報道〔14,15〕，Heregulin誘導的乳腺癌細胞系MCF-7中，基質金屬蛋白酶(MMP)-7、MMP-1及MMP-9的mRNA及蛋白表達均上調，且MMPs降解胞外基質，促進腫瘤浸潤遷移的活性也顯著提高。在肝細胞癌HCC2998和MKN45-1細胞中，Heregulin-β1被發現可誘導細胞表面細胞間接觸的缺失及增強MUC1表達，進而促進腫瘤的形成〔16〕。Heregulin在結腸癌中的表達及其作用正引起學界的密切關注，但目前所見研究較少，具體機制尚未明確。Yoshioka等〔17〕報道，在發生肝轉移的結腸癌患者，肝細胞衍生的Heregulin可能通過增強integrin αvβ5介導的細胞遷移以及ErbB3/ErbB2信號轉導途徑，在結腸癌的細胞遷移和肝轉移過程中，發揮重大作用。本研究提示結腸癌中Heregulin過表達與腫瘤演進侵襲關系密切。

VEGF是腫瘤研究的一個熱點〔18〕。VEGF在腫瘤組織中的表達水平比周圍的正常組織要高，并與腫瘤的惡性程度相關〔19〕。大量研究表明〔20,21〕，新生血管、淋巴管的形成，在結腸癌等腫瘤的發生發展及轉移過程中起著極其重要的作用，而VEGF通過作用于其特異的VEGFR，參與了腫瘤新生血管、淋巴管的形成過程，與腫瘤的惡性程度及預后密切相關。近年還有學者發現〔22,23〕，VEGF-C表達的下調或VEGF/VEGFR2通路的下調可減慢腫瘤生長，抑制腫瘤轉移，并指出結腸癌中卡培他濱的抗瘤效應正是與其下調VEGF表達抑制血管生成作用密切相關。然而，結腸癌中Heregulin是否可通過調節VEGF的表達影響血管新生促進腫瘤浸潤侵襲卻鮮見報道。Nagashima等〔24〕在對乳腺癌的體外研究中發現，Heregulin-beta1刺激乳腺癌上皮細胞后，可誘導VEGF mRNA及蛋白表達，以VEGF依賴方式刺激血管生長。

綜上所述，在人類結腸癌組織中，過表達的Heregulin可能通過某信號通路促進VEGF基因啟動區的活性，強化VEGF的基因轉錄，上調瘤組織中VEGF蛋白表達，以VEGF依賴方式誘導新生血管形成，促進腫瘤浸潤轉移，具體信號通路及其機制尚待深入研究。

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