酒精性肝硬化患者維生素D受體基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性

張中琴

(鶴壁傳染病醫(yī)院,河南 鶴壁 458000)

西方國(guó)家肝細(xì)胞癌(HCC)多伴有肝硬化〔1,2〕。酒精、B型肝炎(HBV)和C型肝炎(HCV)是肝硬化和HCC的主要病因。HBV和HCV可直接導(dǎo)致肝致癌作用，對(duì)感染性肝癌的發(fā)生有重要影響〔1，2〕，這一現(xiàn)象亦可之于酒精性肝炎〔3〕。維生素D受體(VDR)的轉(zhuǎn)錄活性受到配體的調(diào)制，如類固醇、維甲酸類、其他一些脂溶性化合物，并受核蛋白如激活因子和抑制因子的活性影響〔4，5〕。12q13.1位點(diǎn)的VDR基因組長(zhǎng)約100 kb，具有促發(fā)多種遺傳組織特異性轉(zhuǎn)錄的能力〔6〕。VDR多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、結(jié)-直腸癌、膀胱癌和腎癌的關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，雖然還存在不同的見解。而且，VDR的多態(tài)性影響前列腺癌和乳腺癌的預(yù)后，對(duì)腎細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤的預(yù)后也有影響〔7～9〕。VDR多態(tài)性在慢性肝病如原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎中也已進(jìn)行了研究〔10〕。但是，VDR多態(tài)性和HCC發(fā)生之間的可能關(guān)系目前所知甚少。本研究旨在觀察VDR多態(tài)性和肝硬化HCC發(fā)生之間的關(guān)系，探討肝病病因?qū)@一關(guān)系的影響。

1 材料和方法

1.1病人選擇 共納入250例病人，肝硬化病因C型肝炎(70例)、B型肝炎80例、酒精性肝炎100例。主要人口學(xué)和臨床特征見表1。200例健康成人作為對(duì)照組，男130例；中位年齡48(18～77)歲。 病人和對(duì)照組的男性分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(65.0% vs 68.2%)。但是病人和對(duì)照組年齡存在顯著差異〔(54±8)vs(46±13)歲，P< 0.000 1〕。對(duì)照組無(wú)任何肝病臨床和(或)實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，同時(shí)排除糖尿病等疾病。

1.2組織學(xué)檢查 所有病人均進(jìn)行肝活檢確定肝病變。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的染色技術(shù)檢測(cè)HCC〔11〕。

1.3維生素D檢測(cè) 采集血標(biāo)本，分離并保存于-80℃待測(cè)。循環(huán)25-羥維生素D濃度應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。血清維生素D參考值采用文獻(xiàn)資料〔12〕，即血清維生素D濃度<10～15 ng/ml。

1.4分子生物學(xué)檢測(cè) 基因組DNA應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen,Milan,Italy)根據(jù)操作說明書由全血分離。VDR基因型分為4個(gè)二對(duì)位多態(tài)基因組： FokI C>T(rs10735810)和TaqI T>C(rs10735810)，BsmI A>G(rs1544410)和 ApaIG>T(rs7975232) 。為了檢測(cè)VDR 多態(tài)性，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR) 進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。按文獻(xiàn)〔8〕。方法設(shè)計(jì)引物：上游： 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA -3'，下游： 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC -3'。引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。加相應(yīng)體積的無(wú)菌超純水至總體積50 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)條件為94℃變性、66℃退火、 72℃延伸各1 min，40個(gè)循環(huán)后再延伸10 min。預(yù)先制備1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)。取PCR產(chǎn)物5 μl加6×Loading Buffer 1 μl，小心加樣于膠孔中，于一側(cè)膠孔中加入DNA marker 6 μl，以100 V電壓電泳30 min，用紫外線凝膠圖像分析系統(tǒng)分析并保存。取PCR 產(chǎn)物0.1 μg進(jìn)行ApaⅠ酶切，酶切總體積為15 μl，加無(wú)菌超純水至15 μl置入電熱恒溫水浴箱中，反應(yīng)溫度為37℃，消化3 h。酶切終止后應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳，100 V電壓電泳30 min，然后用紫外線凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肝臟組織學(xué)檢查 檢出HCC 80例，33例HCV陽(yáng)性，16例HBV陽(yáng)性，31例為酒精性肝病(見表1)。

2.2VDR 多態(tài)性 FokI C>T(F/f)、 BsmI A>G(B/b)、ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) 等位基因和基因型頻率見表2。 病人和對(duì)照組的基因多態(tài)性遵循Hardy-Weinberg基因平衡原則。病人和對(duì)照組之間的等位基因或基因型頻率無(wú)顯著差異。BsmI和 TaqI (R2=0.92)之間存在顯著的連鎖不平衡，ApaI和TaqI(R2=0.46)、BsmI和ApaI(R2=0.48)之間也存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

2.3VDR多態(tài)性與肝臟疾病病因關(guān)系 根據(jù)群體樣本配對(duì)比較顯示病毒性肝硬化和酒精性肝硬化之間存在顯著差異(P<0.01)。 單核苷酸基因多態(tài)性的差異檢測(cè)顯示： FokI C>T(F/f)(P=0.720)； BsmI A>G(B/b)(P= 0.047)；ApaI T>G(A/a)(P= 0.052)； TaqI T>C(T/t)(P=0.065)。

2.4VDR 多態(tài)性與HCC HCC病人攜帶b/b基因型和T/T基因型較其他基因型多見。 就BsmI A>G(B/b)、ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) 來說，A-T-C單基因攜帶最多見于無(wú)HCC患者，而G-T-T最多見于HCC患者。根據(jù)不同基因攜帶分為攜帶BAT A-T-C基因組(n=128)、攜帶BAT A-T-C和G-T-T基因或均不攜帶這兩種基因組(n=73)、攜帶G-T-T單基因組(n=38)，檢出HCC的頻率分別為27.0%、38.7%和43.6%。逐步Logistic回歸分析確定攜帶BAT A-T-C和G-T-T單基因型、年齡(≤50歲、>50歲)、體質(zhì)指數(shù)(<25 kg/m2、≥25 kg/m2)、Child-Pugh 評(píng)分(≤8、>8)對(duì)預(yù)測(cè)HCC的發(fā)生的價(jià)值，結(jié)果顯示攜帶A-T-C和G-T-T單基因型可預(yù)測(cè)HCC發(fā)生，且獨(dú)立于年齡、性別、病毒因素、體質(zhì)指數(shù)。

表1 肝病患者的人口學(xué)和臨床特征±s)

表2 肝硬化和對(duì)照組的等位基因和基因型

2.5VDR多態(tài)性和肝硬化和HCC病因?qū)W關(guān)系 根據(jù)病因?qū)W對(duì)肝硬化分級(jí)組，病毒因素、酒精因素、HCC、非HCC，這4個(gè)群體間存在顯著差異(P<0.002)；酒精肝硬化伴HCC和病毒肝硬化伴HCC(P<0.000 1)、病毒性肝硬化無(wú)HCC(P<0.000 1)、酒精肝硬化無(wú)HCC(P<0.01)之間存在顯著差異。

2.6維生素D濃度與VDR單基因和HCC發(fā)生的相關(guān)性 根據(jù)性別和維生素D血清濃度(分點(diǎn)水平15 ng/ml)與HCC的發(fā)生存在線性趨勢(shì)關(guān)聯(lián)。分別比較女性≤15 ng/ml和>15 ng/ml、男性≤15 ng/ml和>15 ng/ml發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì) (0/12,0.0%；2/12,16.7%；16/38,42.1%；26/51,51.0%,P<0.000 5)。維生素D濃度>15 ng/ml與BAT ATC攜帶對(duì)HCC發(fā)生有協(xié)同作用(19.5% vs 44.8%，P<0.02)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，肝硬化病人FokI C>T(F/f)、 BsmI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a)和 TaqI T>C(T/t) 多態(tài)性的等位基因和基因型的頻率與對(duì)照組相近， 特異的多態(tài)性和自身免疫肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化的關(guān)系已經(jīng)得到觀察，雖然存在一些爭(zhēng)議。 實(shí)際上，BsmI A>G(B/b)多態(tài)性的B等位基因與原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)生具有關(guān)聯(lián)〔10〕，還有研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁肝硬化與b等位基因相關(guān)。慢性自身免疫肝炎和F等位基因之間存在關(guān)聯(lián)〔10〕，但也有不同的結(jié)果〔13〕。本研究中的病人為病毒性(HBV或BCV)和酒精性肝病未發(fā)現(xiàn)VDR多態(tài)性的等位基因和基因型頻率與對(duì)照組間存在任何差異。這與在HBV病人和對(duì)照組的觀察結(jié)果一致〔11〕。

本研究結(jié)果表明病毒原因和酒精病因性肝病之間的等位基因存在顯著的差異，即BsmI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a) 和 TaqI T>C(T/t) (BAT) 多態(tài)性的顯著差異與連鎖不平衡有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；相反，F(xiàn)okI C>T(F/f)多態(tài)性在兩病人組間并無(wú)明顯不同。此外，單基因型分析呈現(xiàn)更為顯明的差異，BAT A-T-C單體型在病毒性病變中較之酒精性肝硬化中呈現(xiàn)更多的表達(dá)(0.46%對(duì)0.34%)。這些結(jié)果目前尚難作出清楚解釋，因?yàn)锽smI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) (BAT)多態(tài)性位于VDR基因的未知功能區(qū)。有兩點(diǎn)值得考慮：即， 肝硬化的真正遺傳危險(xiǎn)可能與這多態(tài)性的單體型連鎖不平衡有關(guān)；基因環(huán)境的交互作用具有致病作用。HCC與 BsmI A>G(B/b)多態(tài)性的b等位基因、TaqI T>C(T/t)多態(tài)性的T等位基因有聯(lián)系。BAT A-T-C 單體型與HCC呈相反關(guān)聯(lián)，而BATG-T-T單體型和HCC有直接聯(lián)系；這些關(guān)聯(lián)是獨(dú)立于已知的與HCC發(fā)生有強(qiáng)預(yù)測(cè)價(jià)值的主要的人口學(xué)和臨床變量。VDR多態(tài)性在許多上皮起源腫瘤中得到研究，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺和皮膚癌〔14〕。B BsmI A>G(B/b)等位基因攜帶、t TaqI T>C(T/t)等位基因攜帶對(duì)前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌等有保護(hù)性作用〔15〕；與本研究中結(jié)果相似。本研究結(jié)果提示HCC的發(fā)生和肝硬化病因之間以及VDR多態(tài)性的關(guān)系具有相互影響。分子學(xué)變異分析和估計(jì)單體型頻率突顯酒精性肝硬化伴HCC病人、酒精性肝硬化不伴HCC、病毒性硬化伴HCC以及那些無(wú)HCC的病人的VDR多態(tài)性存在差異。

維生素D在動(dòng)物和細(xì)胞的抗癌活性研究受到廣泛關(guān)注。維生素D的抗癌活性是由于其對(duì)多數(shù)的細(xì)胞群抗增生和 分化作用。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)低維生素。濃度與癌癥高發(fā)生率之間存在關(guān)聯(lián)。維生素D濃度下降在酒精性肝病病人中得到證實(shí)。本研究結(jié)果提示維生素D不足(≤15 ng/ml) 見于半數(shù)以上的病人，經(jīng)性別校正后維生素D不足和HCC之間的關(guān)系仍然顯見。

4 參考文獻(xiàn)

1Holick MF. Resurrection of vitamin D deficiency and rickets〔J〕.J Clin Invest,2006；116(8):2062-72.

2Valdivielso JM,Fernandez E. Vitamin D receptor polymorphisms and diseases〔J〕.Clin Chim Acta,2006；371 (1-2) :1-12.

3Strand MA,Perry J,Jin M,etal.Diagnosis of rickets and reassessment of prevalence among rural children in northern China〔J〕. Pediatr Int,2007；49(2):202-9.

4席衛(wèi)平，楊建平，李連青，等.維生素D受體基因ApaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與維生素D缺乏性佝僂病的研究〔J〕.中華兒科雜志,2005；43(7):514-6.

5李海林，龔曉輝，黃永坤，等.維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與維生素D缺乏性佝僂病易感性研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2005；22(1):105-7.

6楊建平，席衛(wèi)生，李連青，等.維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與兒童佝僂病的關(guān)系研究〔J〕.中國(guó)實(shí)用兒科雜志,2006;21(1):61-2.

7Fountas L,Moutsatsou P,Kastanias I,etal.The contribution vitamin D receptor gene polymorphisms in osteoporosis and familial osteoporosis〔J〕.Osteoporos Int，1999;10(5):392-8.

8Deeb KK,Trump DL,Johnson CS. Vitamin D signalling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics〔J〕.Nat Rev Cancer，2007;7(9):684-700.

9Colston KW. Vitamin D and breast cancer risk 〔J〕. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2008;22(4): 587.

10Fan L,Tu X,Zhu Y,etal.Genetic association of vitamin D receptor polymor-phisms with autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis in the Chinese〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2005;20(2):249-55.

11劉德權(quán),張海超,鄒天寧.維生素D受體基因多態(tài)性與漢族散發(fā)性乳腺癌的相關(guān)研究〔J〕.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011；32(6):91-4.

12莊志剛,余劍敏,蔣蓓琦.乳腺癌患者外周血25羥基維生素D測(cè)定及臨床意義〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010；32(26) : 2244-6.

13胡楊霖,活性維生素D與乳腺癌〔J〕.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2008；22(6):566-9.

14NagPal S,Na S,Rathnachalam R.Nonealeemieactions of vitamin ligands 〔J〕.Endoer Rev,2005；26(5): 662-87.

15Sabba S,Anieter S,Jlinseise N,etalVitamin D receptor gene polymorphisms and haplotypes and postmenopausal breast cancer risk〔J〕.Breast Cancer Res,2008；10(1):17.