急性髓性白血病患者CD87的表達及其意義

柳 嘉 趙松穎 劉 鍵

(河北大學附屬醫(yī)院血液科，河北 保定 071000)

尿激酶型纖溶酶原激活物受體CD87屬于特異性可飽和的受體之一，已有研究證實，其在惡性腫瘤細胞中均存在表達增高的現(xiàn)象，并參與腫瘤細胞的浸潤、轉移或是增殖、分化與信號轉導等〔1〕，但近年來研究證實，在白血病細胞中亦存在CD87的表達〔2〕，本研究以急性髓性白血病患者為研究對象，采用流式細胞術對其進行檢測，以期探索急性髓性白血病患者中CD87表達與臨床表現(xiàn)及預后的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2010年3月至2013年3月在我科就診的48例急性髓性白血病患者，均為初發(fā)者，排除其他嚴重血液疾病、精神疾病，在知情同意的基礎上，歸為觀察組，納入研究。選擇同時間段我科收治的36例急性淋巴細胞白血病患者，對照組，所有患者中男52例，女32例；年齡50～73〔平均(57.8±1.5)〕歲；依據(jù)法國、美國、英國聯(lián)合(FAB)分型標準，其中M1 10例,M2 35例,M3 10例,M4 4例,M5 6例；L1 15例,L 23例,L 31例。

1.2研究方法

1.2.1試劑及材料 淋巴細胞分離液(生產(chǎn)廠家：上海試劑二廠)；CD87單抗(生產(chǎn)廠家：America Diagnostic公司)異硫氰酸熒光素標記羊抗鼠單抗(生產(chǎn)廠家：邦定公司)；胎牛血清(生產(chǎn)廠家：杭州四季青公司)；氟波酯(PMA)(生產(chǎn)廠家：Sigma公司)；RPMI-1640及逆轉錄酶MMLV(生產(chǎn)廠家：Gibco公司)；6寡聚核苷酸引物及RNA酶抑制劑(生產(chǎn)廠家：華美生物工程公)司。

1.2.2流式細胞術檢測方法 取所有患者的骨髓血，通過淋巴細胞分離液，制備單個核細胞懸液，洗滌之后，計數(shù)錐蟲藍活細胞，而后根據(jù)試劑盒中的操作步驟進行檢測，每例檢測5 000～10 000個細胞，以熒光陽性細胞>20%者判斷為陽性。

1.2.3誘導分化白血病細胞株 將白血病細胞株(HL-60、U937、K562)細胞懸浮于含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液之中，而后分別加入PMA，保持細胞起始密度為2×105/ml，而后將其放置在溫度與條件適宜的培養(yǎng)箱之中5 d，分別在不同時間段(T0=作用前、T1=作用后1 d、T2=作用后3 d、T3=作用后5 d)采用流式細胞術檢測CD87的表達變化情況。

1.2.4細胞形態(tài)觀察及硝基四氮唑藍(NBT)還原試驗 將白血病細胞株細胞在前述不同時間段分別進行細涂片拍樣，進行瑞氏染色后于光鏡下觀察形態(tài)。另取部分培養(yǎng)細胞懸液加入等量0.2%NBT Hank液混勻后，37℃孵育后進行離心制片，瑞氏染色，進行陽性細胞計數(shù)。

1.2.5逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測方法 根據(jù)CD87 cDNA序列設計合成引物(由法國Genset公司合成)，將設計好的引物序列，其中β-actin作為內參照(由中國科學院上海細胞所合成)的引物序列為，根據(jù)試劑盒中的操作步驟，依次進行提取總RNA、計算RNA濃度、逆轉錄、擴增，最后行糖凝膠電泳，在紫外光度分度儀下進行觀察與照相，并采用GS300吸光度掃描儀(生產(chǎn)廠家：Hoefer Scientific Instruments公司)進行定量分析。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1兩組患者的CD87表達情況 觀察組中患者CD87的陽性率(54.17%)顯著高于對照組(0%)(P<0.01)。

2.2CD87陽性與陰性者在臨床表現(xiàn)及預后的比較 與陰性者比較，CD87陽性者的髓外浸潤比例與外周血幼稚細胞均升高明顯(P<0.01)，CR比例則降低明顯(P<0.05)。見表1。

2.3白血病細胞誘導分化過程中不同時間段CD87表達變化 隨著時間的增加，白血病細胞株的CD87表達，均呈現(xiàn)增加的趨勢，其中U937在作用前其陽性表達率即已達到(92.3±4.4)%，其作用主要表現(xiàn)為熒光強度的改變。見表2。

2.4PMA作用前后白血病細胞CD87 mRNA水平變化 PMA作用前，U937中CD87 mRNA含量明顯高于HL-60、K562(P<0.01)；經(jīng)PMA作用后，三組細胞株中的CD87 mRNA均明顯增加(P<0.05)。見表3。

表1 CD87陽性與陰性者在臨床表現(xiàn)及預后的比較〔n(%)〕

表2 白血病細胞誘導分化過程中不同時間段CD87表達變化±s)

表4 PMA作用前后白血病細胞CD87 mRNA水平變化±s)

3 討 論

尿激酶型纖溶酶原激活物受體CD87作為糖化磷脂酰肌醇(GPI)-錨膜蛋白，分子量在55 000～60 000之間,可對于細胞膜上的纖溶酶進行識別，并與其激活物相結合，組成蛋白水解系統(tǒng)，參與白細胞浸潤及組織重建〔2〕。CD87主要在成熟的粒、單核及嗜酸細胞中表達，在正常造血前體細胞不表達〔3〕。

尿激酶(uPA)通過CD87結合于細胞表面，其主要通過將結合于細胞表面鄰近的纖溶酶原進行激活，并將其轉變?yōu)榭山到庖恍┘毎饣|成分的纖溶酶，同時，其還可將其他金屬蛋白酶原進行激活以降解細胞外基質。可見，CD87在細胞組織的纖溶中發(fā)揮著重要作用，主要涵蓋啟動、定位和擴大作用，同時，其還可參與多種生理病理過程，包括組織修復、血管形成以及腫瘤浸潤轉移等〔4〕。CD87主要表達于成熟的粒、單核細胞，其已脫離骨髓及血管，在組織中游走而參與炎癥及免疫反應〔5〕。在白血病分型中，M5中多見CD87的表達，而M5型患者多出現(xiàn)肝、脾、皮膚、黏膜等髓外組織浸潤表現(xiàn)。推測白血病細胞CD87表達可能與其脫離骨髓進入外周血循環(huán)以及對髓外組織的浸潤有關。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，CD87表達與急性髓性白血病的臨床表現(xiàn)以及生物學特性有關，可作為判斷預后的指標。同時，白血病細胞株的CD87表達，隨著時間的增加，其表達均呈現(xiàn)增加的趨勢，這可能與CD87表達使白血病細胞表面纖溶活性增高的原因主要與其浸潤能力有關，其高表達是髓系細胞成熟與分化較好的標志。但是研究中亦發(fā)現(xiàn)，PMA誘導前K562細胞未檢出CD87表達，但RT-PCR檢測其mRNA有少量表達，推測這可能與誘導前僅少量表達于胞質內有關。

綜上，CD87可用于急性髓性白血病的診斷及預后判斷中，具有較好的應用價值。而CD87亦參與細胞的信號傳導，但其機制，尚不清楚，這也為今后的研究指明了方向。

4 參考文獻

1柳 嘉，趙松穎，郭慧梅，等.uPA和uPAR在老年急性髓系白血病中治療前后表達的變化〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(8):1774-5.

2張 麗，梁英民.白血病干細胞的分子調控〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2009;9(10): 1998-2001.

3張連成.TEM8與uPA的相互作用及其生物學意義研究〔D〕.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院博士畢業(yè)論文,2013.

4劉寶芹，邵雪齋，方艷秋.急性髓系白血病中uPA和uPAR的表達及意義〔J〕.中國實驗診斷學， 2011;15(5)：891-2.

5賈國榮，李志芹.急性髓系白血病患者治療前后T淋巴細胞亞群測定的臨床意義〔J〕.標記免疫分析與臨床， 2011;18(2)：76-9.