轉Nanog基因對6-羥基多巴胺帕金森病大鼠腦核因子-κB表達的影響

陳施艷 馮飛陽 張志堅 周海濤 吳秀麗

(福建醫科大學附屬第一醫院神經內科，福建 福州 350005)

帕金森病(PD)是一種中老年人常見的運動障礙疾病，以選擇性中腦黑質多巴胺(DA)能神經元死亡及腦內出現Lewy小體為主要病理特點〔1〕。研究提示核因子(NF)-κB的激活與PD的病理機制有關〔2～6〕。Nanog是2003年Chambers等〔7〕和Mitsui等〔8〕分別用不同的研究戰略同時克隆得到的基因，能不依賴于LIF/Stat3獨自維持囊胚內細胞團(ICM)和胚胎干細胞(ESC)的多能性，從而得到高度重視。Torres等〔9〕在研究Nanog維持干細胞分化潛能作用時意外發現Nanog 蛋白能與NF-κB蛋白結合，并抑制NF-κB的轉錄。本研究設想通過抑制NF-κB的轉錄來延緩PD的病理過程，從而達到治療該病的目的。在前期研究已成功構建攜帶Nanog基因的慢病毒載體，并證實其能抑制小鼠骨髓間質細胞中NF-κB的表達〔10〕，以及抑制脂多糖誘導的大鼠小膠質細胞中NF-κB的轉錄〔11〕，同時證實了6-羥多巴胺(6-OHDA)誘導的PD大鼠模型腦內存在炎癥因子的升高〔11〕。為考察轉Nanog基因在活體上的作用，本試驗擬初步觀察轉Nanog基因對6-OHDA誘導的PD大鼠模型腦內NF-κB表達是否有影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠48只，體重250～300 g(上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證：SCXK滬2007-0005)。動物常溫飼養,自由攝食、飲水，光照12 h，術前12 h 禁食。

1.2主要材料 ①慢病毒載體質粒PNL-IRES .EGFP，包裝質粒HELPER，包膜質粒VSVG以及293T細胞均由美國杜蘭大學陳一平教授惠贈。②Top10菌：由福建醫科大學林建銀教授惠贈。③主要試劑：逆轉錄酶、限制性內切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ(Promega)，高保真Pfu ultra DNA聚合酶(Strategen)，Trizol以及脂質體lipofectamin 2000(Invitrogen)，polybrene(Sigma)，質粒抽提試劑盒(Qiagen)，DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物公司)。胎牛血清(PAA)，DMEM、胰酶、EDTA，青鏈霉素(Gibco)，6-OHDA、阿樸嗎啡(APO，Sigma公司)，兔抗大鼠TH單克隆抗體、兔抗大鼠NF-κBp65多克隆抗體(武漢博士德公司)，TRITC羅丹明標記羊抗兔IgG多聚體、辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體、DAB(北京中衫金橋公司)，多聚甲醛、DAPI染色液、免疫染色封閉液(碧云天公司)。腦立體定向儀(江灣一號)，冰凍切片機(CRYOTOME SME，英國Thermo Shandon公司)，倒置相差熒光顯微鏡(IX70，日本OLYMPUS公司)，激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5，德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1攜帶Nanog基因慢病毒載體構建、鑒定 慢病毒載體的構建與鑒定課題組已在前期完成，所獲病毒載體滴度為6.1×106～6.8×106IU/ml。該慢病毒載體質粒基因序列中的目的基因與Egfp基因之間以IRES(內部核糖體進入位點)相連接，使二者轉錄出一條單順反子，同時翻譯出兩種蛋白，從而通過觀察EGFP的表達直觀地觀測目的基因的表達。構建的載體的鑒定見已發表論文〔10〕。

1.3.2PD大鼠模型的制備 采用腦立體定向儀注射6-OHDA誘導方法制備PD大鼠模型〔12，13〕。用微量注射器將3 μl濃度為2 μg/ μl的6-OHDA(含0.2%抗壞血酸)分別緩慢勻速地注射到大鼠左側紋狀體內的上述各點，注藥速度為1 μl/min，留針10 min后緩慢退針(以1 mm/min速度)，再用微量注射器將5 μl攜帶Nanog基因的慢病毒載體，或5 μl慢病毒空載體，或同劑量PBS分別注射到6-OHDA+Nanog組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組大鼠左側紋狀體內的上述各點。用骨蠟封閉顱骨孔，縫合皮膚，置籠喂養。術后7 d內，每天經腹腔給予20萬U青霉素以預防感染。

1.3.3實驗分組 清潔級雄性SD大鼠48只(剔除術后死亡1只，無體征4只)，隨機分4組：①正常對照組(n=12)； ②6-OHDA+PBS組(n=12)； ③6-OHDA+PNL組(n=12)； ④6-OHDA+Nanog組(n=12)。因預實驗顯示動物在注射6-OHDA后近14 d才有明顯旋轉行為改變，上述各組再按時間點分為注射后第1天(n=6)、注射后第14天(n=6)亞組。所有動物均在室溫22～25℃飼養，光線12 h交替，自由飲水、進食，在實驗前經反復檢測無異常旋轉行為。

1.3.4APO誘發旋轉觀察 于注射后每天經腹腔注射0.5 mg/kg的APO，誘發大鼠向健側旋轉，注射后5 min觀察各組大鼠旋轉行為的改變，計算大鼠每分鐘的旋轉次數，計算標準以動物向注射對側不改變方向旋轉360°計為旋轉1次，每只動物每次記錄30 min，直至第14天。

1.3.5TH免疫組化檢測 各亞組動物分別在注射后第1天與第14天，用10%水合氯醛麻醉后，經升主動脈注入肝素生理鹽水及4%多聚甲醛溶液進行灌注固定，斷頭取腦置固定液中過夜。于中腦區行冰凍連續冠狀切片，厚約20 μm，自前囟后5 mm層面開始，每隔5張選取一張，每5張為一組，共取4組。一組用于TH免疫組織化學染色。免疫組織化學步驟按照免疫組化試劑盒說明書進行。在顯微鏡下觀察，胞質棕染者可判定為TH陽性細胞。每只大鼠的5張切片置顯微鏡下計數黑質區TH免疫反應陽性神經元，分別累計大鼠注射側黑質區TH免疫反應陽性神經元數目。

1.3.6腦內Nanog基因表達的觀測 各亞組的取材同1.3.5步驟，取一組用于腦內Nanog基因表達的觀測。在熒光顯微鏡下，切片中注射針道周0.5 mm 范圍內任意選4個視野，計算其表達綠色熒光的細胞個數，取均數。

1.3.7NF-κBp65免疫組化檢測 各亞組的取材同1.3.5步驟。取一組用于NF-κBp65免疫組織化學染色。免疫組織化學步驟按照免疫組化試劑盒說明書進行。在顯微鏡下觀察，胞質棕染者可判定為NF-κBp65陽性細胞。每只大鼠的5張切片置顯微鏡下計數紋狀體區NF-κBp65免疫反應陽性神經元，每張切片在高倍鏡下(×200)隨機選擇3個視野，計數陽性細胞數，累計后取平均值。

1.3.8共聚焦顯微鏡技術檢測NF-κBp65的表達 各亞組的取材固定同1.3.5步驟。取一組用于共聚焦顯微鏡技術檢測NF-κBp65的表達。

1.4統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1APO誘發旋轉 大鼠注射后1～7 d的各亞組均未誘發旋轉，第8～9天除正常對照組外，有約1/2大鼠可誘發旋轉，在注射后第10～14天各組均可誘發旋轉，在第14天6-OHDA+Nanog組(5.25±0.96)r/min，大鼠APO誘發的旋轉次數低于6-OHDA+PNL組(8.34±2.75)r/min與6-OHDA+PBS組(8.82±1.75)r/min(均P<0.05)。

2.2Nanog基因在腦內的表達 6-OHDA+PBS組幾無綠色熒光表達，而在6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的針道周圍0.5 mm范圍內觀察到大量綠色熒光陽性細胞，且兩組之間的陽性細胞數差異無統計學意義。見圖1、表1。

表1 各組大鼠腦內綠熒光陽性細胞數±s,n=6)

2.3各組大鼠中腦黑質TH陽性神經元的觀察 大鼠注射側中腦可見TH陽性神經元分布于黑質，其形態為大多角形或錐形，胞質棕染。注射后第1天，6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組損毀側的TH陽性細胞數與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；注射后第14天，除正常對照組外，其他各組大鼠黑質TH陽性細胞數普遍較注射后第1天減少(P<0.01)，但6-OHDA+Nanog組損毀側黑質存活的TH陽性細胞數高于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組(P<0.01)，見圖2、表2。

2.4各組大鼠紋狀體區NF-κBp65陽性神經元的觀察 注射后第1天，正常組幾乎未見NF-κBp65表達，6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組NF-κBp65陽性表達均明顯增高，但組間差異無統計學意義(P>0.05)；注射后第14天6-OHDA+Nanog組陽性細胞數低于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組，也低于本組注射后第1天。見圖3、表3。

表2 各組大鼠注射側腦組織黑質TH陽性細胞數±s,n=6)

圖1 各組大鼠腦紋狀體綠熒光陽性細胞(×200)

圖2 各組大鼠腦組織黑質TH陽性細胞的表達(DAB，×200)

表3 各組大鼠腦紋狀體區NF-κBp65表達陽性的細胞數±s,n=6)

圖3 各組大鼠腦組織紋狀體NF-κBp65的表達(DAB，×200)

2.5共聚焦顯微鏡觀察NF-κBp65的定位表達及變化 激發/發射波長為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示病毒載體轉染存活；激發/發射波長為340/488 nm的DAPI呈藍光熒光，表示組織的細胞核染色；激發/發射波長為488/525 nm的TRITC呈紅色熒光，表示NF-κBp65的表達。在共聚焦顯微鏡下，觀察到注射后1、14 d的6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的病毒載體轉染均存活，表達綠色熒光。注射后1 d、14 d的6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的NF-κBp65都有明顯的表達，并向核內轉移。見圖4，圖5。

圖4 熒光染色觀察第1天NF-κBp65在各組大鼠腦組織紋狀體的表達情況(×400)

圖5 熒光染色觀察第14天NF-κBp65在各組大鼠腦組織紋狀體的表達情況(×400)

3 討 論

Hebert等〔14〕在多次動物實驗中均證實阻斷NF-κB激活能保護黑質DA能神經元。為證實這一可能及探討有效的阻斷NF-κB方法，Hill等〔15〕發現Nanog可以與Stat3協同作用抑制NF-κB的活性從而維持小鼠胚胎干細胞的多潛能性，Torres等〔9〕發現Nanog能與NF-κB蛋白結合，并抑制NF-κB的轉錄。Nanog基因存在于人與動物的基因組，只是在發育的后期處于沉默狀態，如果在疾病的情況下，活化該基因就有可能帶來有益的治療效果。因此，我們前期構建了攜帶Nanog基因的慢病毒載體，并證實Nanog能較為完全地抑制小鼠骨髓間質細胞中NF-κB的表達〔10〕，又證實了Nanog能抑制脂多糖誘導的大鼠小膠質細胞中NF-κB的轉錄〔10〕。在上述基礎上，本實驗采用6-OHDA低劑量單側毀損的方法建立PD大鼠模型，植入已帶有Nanog基因的慢病毒載體來觀察轉Nanog基因的表達對NF-κB的表達是否有抑制作用。結果顯示注射后14 d 6-OHDA+Nanog組損毀側的紋狀體NF-κBp65的表達強度低于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組，同時其黑質存活的DA能神經元較多，而且APO誘發的向健側旋轉次數減少，這與Blandini等〔16〕報告的黑質紋狀體系統的DA能神經元損毀程度與APO誘導后大鼠向健側的旋轉圈數呈正相關是一致的，也表明6-OHDA誘導的PD大鼠經轉Nanog基因后黑質紋狀體系統的DA能神經元損毀程度較輕，這種減輕很可能來源于Nanog對NF-κBp65的抑制。

綜上所述，雖然本實驗還較為初期，但其結果提示Nanog對NF-κBp65的抑制在一些特定疾病的治療很可能具有較好效果。由于Nanog蛋白是生物體內的天然蛋白，不屬外來物質，推測在臨床上應用會有一定優勢。但如何在特定條件、特定時間與特定部位啟動Nanog基因，可能還有一段較長的路要走，繼續探討是很有意義的。

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