硒化殼聚糖對K562/ADM細胞生物學行為的影響

鄧守恒 蔡曉軍 潘東風 李 芳 李林均 陳 萍

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

白血病的發(fā)病年齡高峰為50～69歲，已成為當今威脅老年人身心健康的重大疾病之一〔1〕。三氧化二砷(As2O3)可用于治療白血病，最新的研究又證實它能恢復部分耐藥的腫瘤細胞對化療藥物的敏感性〔2,3〕。硒和砷在化學周期表中屬同族，硒化殼聚糖〔4〕是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備成的有機硒，具有高效低毒的特性。前期的研究結(jié)果表明，硒化殼聚糖可通過多條途徑對體外培養(yǎng)的多種白血病細胞K562、HL-60、NB4產(chǎn)生抑制增殖和誘導凋亡的作用〔5～7〕。由于砷劑尚具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，硒化殼聚糖理應也具有相同的功能。

1 材料與方法

1.1試藥試劑與儀器 硒化殼聚糖(批號：100601-201016)由本院化學系合成，含硒量為0.8%；阿霉素(ADM)為浙江海正藥業(yè)產(chǎn)品；碘化丙啶(PI)為Sigma產(chǎn)品；Western 印跡試劑盒為Promega產(chǎn)品； P-糖蛋白(P-gp)單抗及二抗為Santa Cruz產(chǎn)品； Trizol總RNA抽提試劑盒、RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis kit 為Fermentas產(chǎn)品；MDR-1及β-actin引物由上海生工公司合成。Epics Elite ESP型流式細胞儀(Coulter公司)；AM-PLITRON Ⅱ型PCR擴增儀(Barnscread/Thermolyme公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人慢性粒細胞白血病耐阿霉素細胞株K562/ADM購自中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和2 U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為0.6 μg/ml阿霉素以維持其耐藥性，于37 ℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔3～4 d傳代1次。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集指數(shù)生長期K562/ADM細胞以全培養(yǎng)液稀釋成5×104個/ml單細胞懸液，接種于12孔板，每個濃度復種4孔，于37 ℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，將細胞分為陰性對照組(含1640培養(yǎng)基)、ADM組(含50 μg/ml ADM)、25、50、100、200、400 mg/L硒化殼聚糖組(含50 μg/ml ADM)，各組加樣后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，1 000 r/min離心5 min收集細胞，鹽緩沖液(PBS)洗3次后于細胞沉淀中加70%乙醇1 ml，-20℃固定24 h，加入PI (終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min，用流式細胞儀作DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算細胞凋亡率和各時相細胞的百分比。

1.2.3Western 印跡法檢測細胞P-gp表達 細胞分組同1.2.2，作用24 h后收集各組細胞各3×105個，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細胞總蛋白，進行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入P-gp一抗和二抗，顯色，拍照， Quanti Scan軟件，進行密度掃描分析。

1.2.4RT-PCR法檢測細胞MDR-1 mRNA表達〔8〕細胞分組同1.2.2，作用24 h后收集細胞，用Trizol提取細胞總RNA，合成cDNA，PCR反應引物為，MDR-1上游引物：5′CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG3′，下游引物：5′GTT CAA ACT TCT GCT CCT CA3′，擴增產(chǎn)物為157 bp；β-actin上游引物：5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG3′，下游引物為：5′GAC CAC AGT CCA TGA CAT CAC T3′，擴增產(chǎn)物為450 bp。PCR反應體系為：上下游引物各15 pmol/L，Taq酶1 U，dNTP5 nmol/L，cDNA模板2 μl，94℃ 5 min后，94℃ 30 s， 55℃ 60 s ,72℃ 70 s，28個循環(huán)，最后72℃ 10 min結(jié)束反應。取20 μl擴增產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈下觀察并照相，經(jīng)凝膠圖像分析儀分析，根據(jù)MDR-1與β-actin灰度比值，進行半定量分析。

1.3統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1硒化殼聚糖對K562/ADM細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的K562/ADM細胞凋亡率很低，經(jīng)50 μg/ml ADM單獨及聯(lián)合50、100、200 mg/L硒化殼聚糖作用12 h則可明顯誘導細胞出現(xiàn)凋亡(P=0.009、0.007、0.004、0.000)。與單純ADM作用組比較，與50～200 mg/L硒化殼聚糖聯(lián)合則能顯著增強ADM對K562/ADM細胞的誘導凋亡作用(P<0.01)。細胞周期分析結(jié)果顯示，單純ADM能夠增加G1期細胞比例，降低S期細胞比例(P=0.021)和(P=0.044)。而與硒化殼聚糖聯(lián)合作用后，G1期細胞比例進一步增加， S期細胞比例進一步降低，硒化殼聚糖劑量越大作用效果越明顯(P<0.01)，說明ADM單獨及聯(lián)合硒化殼聚糖均可通過阻滯K562/ADM細胞于G1期誘導細胞凋亡(見表1)。

2.2硒化殼聚糖對K562/ADM細胞P-gp表達的影響 免疫印跡及灰度掃描結(jié)果顯示， P-gp蛋白在K562/ADM細胞內(nèi)呈高表達(灰度值為1.212 3±0.31)。經(jīng)100 mg/L或200 mg/L硒化殼聚糖作用24 h后，K562/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白灰度值分別降至(0.598 4±0.03)和(0.205 9±0.06),下調(diào)率分別為(50.52±2.17)%和(81.02±2.57)%，與未處理K562/ADM細胞比較，均有顯著性差異(P<0.01)(見圖1)。

2.3硒化殼聚糖對K562/ADM細胞MDR-1mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，三組均可在157 bp處見清晰的MDR-1基因陽性條帶。半定量分析結(jié)果顯示，未處理K562/ADM細胞內(nèi)MDR-1基因表達比值為0.7623±0.05,經(jīng)100 mg/L或200 mg/L硒化殼聚糖作用24 h后，基因比值分別降至0.443 1±0.17和0.142 6±0.24,與未處理K562/ADM細胞比較均有顯著性差異(P<0.01)。100 mg/L硒化殼聚糖可使K562/ADM細胞MDR-1基因表達下調(diào)(40.87±3.19)%，200 mg/L硒化殼聚糖使其下調(diào)(78.24±3.42)%，見圖2。

表1 硒化殼聚糖對K562/ADM細胞凋亡及周期時相的影響±s,n=4，%)

1～3:K562/ADM細胞組，100、200 mg/L硒化殼聚糖組，下圖同

圖2 硒化殼聚糖對K562/ADM細胞MDR-1 mRNA的影響

3 討 論

K562/ADM細胞是體外利用小劑量ADM誘導建立的慢性粒細胞白血病多藥耐藥細胞株，具有典型的高表達MDR-1基因及P-gp MDR特征，其對多種化療藥物，如ADM、長春新堿、柔紅霉素等耐藥〔9〕。本研究結(jié)果表明，單純ADM能夠?qū)δ退幖毎a(chǎn)生一定的誘導凋亡和細胞周期阻滯作用，但作用效果非常有限，說明K562/ADM細胞確實存在對ADM的耐藥，而硒化殼聚糖與ADM合用，硒化殼聚糖則能明顯增強K562/ADM細胞對ADM誘導凋亡作用的敏感性，表現(xiàn)在凋亡率的升高和G1期阻滯作用的增強，硒化殼聚糖劑量越高，上述作用效果越明顯。

MDR產(chǎn)生機制很多，其中研究最為清楚的原因的就是在耐藥的細胞中出現(xiàn)了由多藥耐藥基因MDR1編碼，能夠依賴ATP供能，將化療藥物逆濃度梯度泵出細胞的細胞膜P-gp的過表達〔10〕。除此之外，化療藥物在很大程度上是通過誘導腫瘤細胞凋亡起作用的，而腫瘤細胞對化療誘導的凋亡產(chǎn)生抵抗也是耐藥產(chǎn)生的重要機制〔11,12〕。本研究結(jié)果表明，K562/ADM耐藥細胞中確實存在著MDR-1 mRNA和P-gp的高表達，而硒化殼聚糖則能夠顯著下調(diào)該基因和蛋白的表達，硒化殼聚糖劑量越大，下調(diào)作用越顯著。

綜上，硒化殼聚糖能夠通過下調(diào)MDR-1基因和P-gp表達，阻滯細胞周期于G1期等途徑來誘導細胞凋亡并進而對K562/ADM細胞的耐藥生物學行為產(chǎn)生影響，提示其作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑有廣闊的開發(fā)前景，其藥理作用值得進一步深入研究。

4 參考文獻

1鄧守恒，李林均，蔡曉軍，等.硒化殼聚糖通過下調(diào)PML-RARα融合蛋白對急性早幼粒白血病NB4細胞增殖和凋亡產(chǎn)生作用〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(6):1000-2.

2楊東光，張 日，朱子玲.三氧化二砷逆轉(zhuǎn)甲磺酸伊馬替尼對K562/MDR1耐藥的實驗研究〔J〕.蘇州大學學報:醫(yī)學版，2007；27(2):178-81.

3吳廣洲，沈振亞，劉國鋒，等.三氧化二砷對人肺腺癌細胞A549/ DDP裸鼠體內(nèi)的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用〔J〕.蘇州大學學報:醫(yī)學版，2011；31(1):79-83.

4孫蘭萍，張勝義，許 暉.硒化殼聚糖的制備及理化性質(zhì)的研究〔J〕.食品工業(yè)科技，2006；27(2):145-51.

5鄧守恒，李 芳，李林均，等.硒化殼聚糖對慢性粒細胞白血病K562細胞bcr/abl融合基因表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011；17(1):106-9.

6鄧守恒，蔡曉軍，佐志剛，等.硒化殼聚糖對NB4細胞增殖的影響及其與PML-RARα融合蛋白激活的Ras信號途徑的關(guān)系〔J〕.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011；38(6):1074-6.

7鄧守恒，張春香，曾小華，等.硒化殼聚糖對HL60細胞增殖分化的影響〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2010；36(10):1172-5.

8Canstock CE,Kuudesn KE.The complex role of AR signaling after cytotoxic insult implications for cell-cycle based chemotherpeutics〔J〕.Cell Cycle,2007;6(11):1307-13.

9楊純正，劉淑儀.腫瘤耐藥基因表達的臨床意義及其逆轉(zhuǎn)達研究〔J〕.中國腫瘤，2001；10(3):132-6.

10楊慧瑩，趙 麗，郭青龍.P-糖蛋白抑制劑的研究進展〔J〕.實用老年醫(yī)學，2011；25(2):165-9.

11Lage H.An overview of cancer multidrug resistance a still unsolved problem〔J〕.Cell Mollife Sci,2008;65(20):3145-67.

12Canstock CE.Kuudesn KE.The complex role of AR signaling after cytotoxic insult implications for cell-cycle based chemotherpeutics〔J〕.Cell Cycle,2007;6(11):1307-13.