穴位埋線對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及血清白介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達的影響

唐中生 謝高宇 陸 瑩 陳 波 張作濤 羅亞非

(貴陽中醫學院解剖學教研室,貴州 貴陽 550002)

血管性癡呆(VD)是導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征〔1〕。腦缺血再灌注損傷的過程中腦內氧自由基、脂質過氧化產物等有毒代謝產物增多，對腦組織具有明顯的損傷作用，能引起一系列的炎癥因子表達使炎性細胞浸潤，進而加重神經元的損傷〔2〕。缺血與再灌注早期產生的黏附分子和細胞因子構成了缺血性炎性損傷的基礎〔3〕。以白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α為代表的細胞因子在腦缺血后的炎性反應中扮演著啟動因素的角色，且在發病后數天至1 w內占主導作用〔4〕。為探討VD發病與血清IL-1β與TNF-α的關系，本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠學習記憶能力的變化、海馬神經元損傷減緩及血清IL-1β與TNF-α水平，探討穴位埋線治療VD的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2007-0006。

1.2實驗器材 可吸收性外科縫線(經絡疏通專用線)(中國中醫研究院眾益科技開發公司)，電子天平(蘇州精密儀器廠)；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(上海吉量軟件科技有限公司)；微型動脈夾(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術器械廠)；一次性2.5 ml的注射針頭(江西洪達醫療器械集團有限公司)。

1.3藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、IL-1β(美國R&D Systems 公司生產)、TNF-α檢測試劑盒(貴州平生生物技術有限公司提供)；尼莫地平片(正大青春寶藥業有限公司生產，批號：0801002)。

1.4VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機分為假手術組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立VD大鼠模型〔5〕。模型制作成功標準：大鼠在4條血管阻斷后1～2 min內，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.5治療方法 術后第7天開始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進行，每日1次，連續治療15 d。①穴位埋線組。穴位選擇：百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中。 穴位定位：以《實驗針灸學》定位位置為標準〔6〕。治療方法：將可吸收性外科縫線(4～0號)剪成1 cm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時用鑷子將其裝入2.5 ml的注射針頭，然后再將預先剪去針尖的6.7 cm針灸針作為針芯穿入注射針頭內，組成一套埋線工具。埋線時，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內的羊腸線推入穴內，感覺注射針內有空虛感時方可出針，并確認羊腸線已埋入穴位內。②尼莫地平組。按20 mg·kg-1·d-1的用量進行灌胃治療。假手術組、模型組均給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃。

1.6Morris 水迷宮學習記憶能力檢測〔7〕術后第28天開始水迷宮測試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(24±2)℃，池壁上4個等距離點分水池為4個象限，選第3象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6天進行定向航行實驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(各象限水池壁中點)靠池壁放入水中，記錄60 s內大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期；第7天行空間探索實驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數。

1.7血清采集及檢測 Morris 水迷宮檢測之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動脈采集血液，入冰箱靜置過夜后采集血清以備進行IL-1β與TNF-α含量檢測。開顱取腦，取海馬組織固定12 h。經梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續冠狀切片(片厚5 μm)用Biomias99圖像分析系統進行圖像分析。HE染色，光鏡下觀察海馬神經元的病理變化。

2 結 果

2.1穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響 定位航行實驗：平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術組比較明顯延長(P<0.05，P<0.01)，穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)，與尼莫地平組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

空間探索實驗：該實驗反映了大鼠的記憶能力。模型組與假手術組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數減少(P<0.01)，穴位埋線組與模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數增多(P<0.01，P<0.05)，穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義(P>0.05)。見表2。

2.2穴位埋線對VD大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的影響 模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比假手術組顯著升高(P<0.01)，穴位埋線組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量雖然也高于假手術組(P<0.05)，但與模型組大鼠相比明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3穴位埋線對VD大鼠病理形態學的影響 圖1可見，HE染色見假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結構正常，胞質豐富，無膠質細胞增生現象；細胞核呈圓形、橢圓形。模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，神經元嚴重腫脹、變性及排列紊亂，并嚴重壞死，神經纖維增粗紊亂。穴位埋線組海馬CA1區未出現水腫、見輕微血管擴張充血，神經元出現輕微腫脹，未見變性、排列紊亂和壞死，神經纖維現增粗紊亂。尼莫地平組海馬CA1區神經元密集，出現輕微水腫和血管擴張充血，神經元輕微腫脹和變性、無壞死，神經纖維現增粗紊亂。

表1 各組大鼠每天平均逃避潛伏期的測試±s)

表2 各組大鼠空間探索實驗第Ⅲ象限活動時間、穿越站臺次數及血清IL-1β、TNF-α含量±s)

圖1 各組大鼠海馬CA1區神經元病理形態學觀察(HE，×400)

3 討 論

研究表明，不完全的缺血性損傷、局部及遠處的缺血性改變等都與VD有關〔8〕。腦血流中斷和再灌注導致腦細胞壞死或凋亡，反復、多次缺血性腦血管事件發作可誘發認知功能障礙和相關腦血管病的神經功能障礙。研究表明，炎癥反應在慢性腦缺血后繼發性神經損傷中起主要作用〔9〕。腦缺血發生后，血漿及腦組織TNF-α、IL-1β含量均出現變化，并且隨時間變化而變化。IL-1β是一種具有多效性作用的促炎性細胞因子，是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子之一，在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用。IL-1β通過誘導白細胞黏附，介導白細胞向缺血腦組織浸潤，引起腦組織炎癥反應，導致腦組織進一步損傷。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞分泌。在腦缺血再灌注后，TNF-α是最早產生并發揮作用的促炎細胞因子，是炎癥反應的始動因素，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因，它具有增加血管內皮細胞的通透性，誘導細胞黏附因子表達等作用。以IL-1β與TNF-α為代表的炎性細胞因子參與許多神經病理過程，包括腦缺血引起急性神經變性、老年性癡呆(AD)等慢性神經變性。無論是炎性細胞因子過度表達，還是其誘發的其他活性物質的過度表達，都將使反應向不利于機體的方向發展。這些炎癥細胞因子在健康成人腦內含量很低，只有在伴發炎癥及免疫反應的病理情況下才明顯表達增多。IL-1β及TNF-α在腦缺血再灌注損傷引起的炎癥級聯反應中起主要介導作用，體針針刺可抑制炎性細胞因子IL-1β、TNF-α及其mRNA的表達，從而降低組織或血清中其蛋白的含量〔10〕。大鼠急性腦缺血和再灌注30 min后，血漿IL-1β和TNF-α含量均有不同程度升高，循經取穴電針能顯著降低血漿IL-1β、IL-6和TNF-α含量。說明炎性細胞因子及由此介導的炎癥級聯反應參與缺血再灌注腦損傷過程，電針可通過阻斷炎癥級聯反應實現對缺血再灌注腦損傷的保護作用〔11〕。

穴位埋線療法在中醫理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經廣泛應用于臨床各科〔12〕。臨床采用穴位埋線治療VD也取得了一定的效果，但是其治療VD的作用機制還未見報道。中醫認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣滯血瘀。氣虛則神失所養，瘀血則可隨經脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現神識不清，表情癡呆諸癥。本研究選取百會、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠神經元的凋亡變化與埋線治療的療效關系，提供形態學依據。

Morris水迷宮已經廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗?？臻g學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結構應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業而經過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其他動物作業成績產生影響等優點，因而在國內外被廣泛采用〔13〕。本實驗結果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

本研究結果表明，降低血清IL-1β、TNF-α含量、緩解腦缺血后炎癥反應，減輕海馬神經元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機制之一。

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