缺氧誘導因子-1α對SD大鼠心室肌細胞缺血再灌注損傷的短暫保護作用

范林洋 張娜娟 邵 鑫 李小雪 陳 芬 楊春蕾

(四川大學生命科學學院醫學細胞生物學教研室，四川 成都 610041)

缺氧缺血性心腦血管病已成為我國發病率、致殘率和死亡率最高的疾病〔1〕。再灌注曾經被認為是治療缺血缺氧心臟疾病的有效手段，而再灌注后引起的心肌壞死與功能障礙已成為醫學界亟待解決的問題〔2〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是1992年在研究缺氧誘導的促紅細胞生成素(EPO)基因表達時發現的一種核轉錄因子，在缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動物細胞內〔3〕。HIF-1α的分布和作用十分廣泛，在胚胎發育、缺血缺氧性疾病及腫瘤的發展中起著重要作用。但是在心肌細胞水平HIF-1α時效問題的研究目前還未見報道。本實驗探討短暫及長時間HIF-1α對心室肌細胞缺血再灌注損傷(IRI)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SD大鼠新生乳鼠(1～3 d)，雌雄不拘，由四川大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(川) 2006-010。

1.2主要試劑 限制性內切酶BamHⅠ(TaKaRa)，DNA連接酶SolⅠ(TaKaRa)，質粒小量提取試劑盒，Ⅱ型膠原酶(GIBCO)、透明質酸酶(Sigma)、MTT(Sigma)、LipofectamineTM2000(Invitrogen) 、兔抗鼠Bcl-2、VEGF及HIF-1α單克隆抗體(北京中杉公司)；模擬缺血液和模擬再灌注液均參考張娜娟的實驗方法配制；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3方法

1.3.1真核表達載體pcDNA3.1-full length HIF-1α的構建和鑒定 質粒pSPT18-full length HIF-1α由美國Hokkaido大學Jian Chen博士惠贈，pcDNA3.1及大腸桿菌JM109均由華西婦產兒童醫院室屈藝教授提供。將pSPT18-full length HIF-1α及pcDNA3.1兩個質粒分別用BamHⅠ單酶切，膠回收所取片段后DNA連接酶SolⅠ連接。將連接后產物轉化感受態細菌JM109，提取質粒質粒。BamHⅠ單酶切，測序驗證質粒構建是否成功。

1.3.2心室細胞的原代培養及純化 按照張娜娟等所描述的聯合酶消化法分離心室肌細胞〔4〕。取出生1～3 d的乳鼠10只，取心臟，在PⅡ緩沖液中去除心包膜及心房，取心室部分剪碎并消化，200目細胞篩過濾并接種至培養瓶，1 h后取出細胞懸液(此時大部分成纖維細胞貼壁)離心并接種于培養瓶。

1.3.3脂質體轉染心室肌細胞 將提前準備好心室肌細胞接種于30 mm培養皿中，待細胞匯合度達到約80%時，換成無血清無抗生素的DMEM培養基培養過夜。按8 μg質粒+40 μl LipofectamineTM轉染細胞。

1.3.4體外心肌細胞IRI模型的建立 參照張娜娟等的研究方法〔4〕，建立體外心肌細胞IRI模型。將實驗分成缺血再灌注(IR)后正常培養6 h檢測和IR后正常培養5 d再進行檢測兩個體系，每個體系分成4組：對照組，I/R組(正常心室肌細胞IR組)，I/R+full(轉染HIF-1α的IR組)和I/R+NC(轉染空載的IR組)。

1.3.5MTT檢測心室肌細胞活力 收集各組細胞，按2×104/孔接種于96孔細胞培養板。孵育24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT20 μl，孵育4 h后吸除上清，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，酶標儀上檢測吸光值(λ=570 nm)。

1.3.6Western印跡檢測HIF-1α、血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達 胰酶消化各組細胞，4℃預冷的PBS液洗3次后，加入含有亮胰蛋白酶肽(10 μg/ml)，抑肽酶(10 μg/ml)和苯甲基磺酰氟(PMSF，100 μg/ml)的細胞裂解液400 μl，置于冰上10 min，再經沸水浴10 min，離心取上清，收集于新的EP管中。BCA蛋白檢測試劑盒定量后，取50 μg上樣，120 V電泳1.5 h，50 V轉膜45 min后，將膜置于封閉液中封閉1 h。將PVDF膜與TBST稀釋的一抗HIF-1α(1∶250)、VEGF(1∶250)、β-actin(1∶250)進行孵育4℃過夜；TBST洗膜，將膜放入辣根過氧化物酶耦聯的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，洗膜4次，化學發光法顯色。

1.3.7免疫細胞化學分析 將消毒好的蓋玻片放入6孔板，按5×106接種細胞于蓋玻片上，孵育4 h后每孔加入2 ml培養液，20 h后按免疫組化染色試劑盒說明書操作。抗體使用bcl-2(1∶200)。采用Image-Pro Plus 4.5分析軟件陽性表達的積分光密度值，計算平均IOD。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.8流式細胞術檢測 收集四組各1×106個細胞，900 r/min離心5 min去上清，反復兩次，重懸于500 μl PBS溶液中；將細胞懸液放置于2～3 ml預冷的70%乙醇中，混勻，4℃保存30 min。上機前去除固定液，調整細胞濃度至106/ml，加50 μl碘化丙啶(PI，0.4 mg/ml)，0℃～4℃染色30 min后，FACS-420流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1酶切結果 對構建的真核表達質粒pcDNA3.1-full length HIF-1α用BamHⅠ酶切后，可見5.4 kb及2.5 kb兩個條帶出現，表明質粒構建成功。之后質粒測序驗證結果也證明成功構建重組質粒。見圖1。

1：DNA marker DL15000，2：KpnⅠ酶切pcDNA3.1，3：pcDNA3.1，4：BamHⅠ酶切pcDNA3.1，5：pcDNA3.1-full length HIF-1α digested by BamHⅠ，6：pcDNA3.1-full length HIF-1α，7：DNA marker λEcoT14

圖1重組質粒pcDNA3.1-fulllengthHIF-1α酶切圖

2.2MTT測定細胞活力 在IR后培養6 h檢測體系中，與對照組(0.85±0.09)相比，IR組(0.57±0.04)和I/R+NC組(0.60±0.08)心肌細胞活性明顯降低；而I/R+full組(0.78±0.10)IR處理后的心肌細胞活性出現一定程度的改善。正常培養5 d后，I/R+full組(0.52±0.03)細胞活力卻大幅度降低，與IR組(0.42±0.07)差異無統計學意義(P>0.05)。正常培養5 d IR組與IR+NC組(0.57±0.05),對照組(0.77±0.06)無明顯差異(P>0.05)。

2.3Western印跡檢測 見圖2，IR處理6 h后，實驗組與對照組相比：IR組轉染pcDNA3.1-full length HIF-1α的心室肌細胞VEGF表達量明顯增加，且二者呈正相關趨勢；在處理5 d后，重組質粒組的HIF-1α表達仍然較高，但VEGF的表達顯著下降。

2.4免疫細胞化學檢測 在IR后培養6 h檢測體系中，與IR組相比，I/R+full組bcl-2表達較高，而I/R組bcl-2表達下降。但IR組后培養5 d檢測，I/R+full組bcl-2大幅度下降。見表2。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況 與對照組相比，IR 6 h后心室肌細胞凋亡率顯著增加；與IR組相比，轉染重組質粒后凋亡程度明顯下降。但繼續培養5 d后，轉染重組質粒組凋亡率明顯上升，與I/R組比較相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

1～4：對照組；I/R；I/R+full;I/R+NC處理6 h后；處理5 d后

表2 各組心室肌細胞bcl-2基因陽性表達±s,n=6)

表3 各組心肌細胞凋亡率比較±s，%,n=6)

3 討論

IR已逐漸引起醫學界的高度重視〔5〕。研究表明再灌注后反而會引起細胞或組織代謝功能障礙及結構破壞等不可逆損傷，即IRI〔6〕。細胞凋亡是IR組織損傷功能喪失的重要原因，如何有效減輕和防治IR引起的心臟疾病和心肌損傷越來越受到人們的重視。

HIF-1α與心肌缺血、心肌細胞凋亡及心力衰竭等各種心血管疾病有關〔7，8〕。Wang等〔9〕對新生鼠研究發現，HIF-1α在缺氧/復氧狀態下對心肌細胞凋亡起著關鍵作用，HIF-1α可以通過調節bcl-2等凋亡相關基因參與細胞凋亡的過程。

VEGF是相對分子質量34～46 kD的熱穩定蛋白，序列保守。普遍認為，心肌缺血后，HIF-1α和VEGF等基因的表達，可以促進缺血心肌形成新生血管，表現為心肌毛細血管密度及血流量增加，導致心肌肥大〔7〕。本研究中發現，HIF-1α在細胞短期缺血缺氧的環境下，能誘導VEGF的產生，促進缺氧細胞對缺氧的耐受，保障細胞的存活。

bcl-2蛋白家族是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質〔10〕。研究發現在IR人黑色素瘤細胞中，bcl-2可以誘導HIF-1和VEGF高表達〔11，12〕。本研究說明HIF-1α可通過刺激bcl-2的表達阻止心肌細胞凋亡；細胞經IR處理后恢復其良好的培養條件HIF-1α并沒刺激bcl-2的高表達，HIF-1α對心肌細胞的保護作用只是暫時的。本研究結果說明HIF-1α長時間的激活狀態并未對心肌細胞RI起到保護作用。Marion H?lscher等〔13〕也發現在原發性心臟病中HIF-1α只是短期內對心臟有益，與本研究在細胞水平研究的結果一致。

4 參考文獻

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13Marion H?lscher，Katrin Sch?fer，Sabine Krull，etal.Unfavourable consequences of chronic cardiac HIF-1α stabilization〔J〕.Cardiovasc Res，2012；94(1)：77-86.