p38蛋白激酶抑制劑SB203580對重癥胰腺炎大鼠急性肺損傷的保護作用

朱保月 蘇曉陽 李 敬 杜艷雪 高 珣 張建軍

(衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院急診科，湖北 衡水 053000)

重癥急性胰腺炎發(fā)病機制較為復雜，發(fā)病時并發(fā)多系統(tǒng)臟器功能不全是急性重癥胰腺炎死亡的主要原因，其中急性肺損傷是最常見的并發(fā)癥，相當一部分患者迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，是重癥胰腺炎早期死亡的最主要原因〔1〕。本研究探討p38抑制劑SB203580在重癥胰腺炎大鼠肺損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1動物模型制備、分組及標本采集 健康成年清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，實驗前禁食、水，隨機分為假手術組：開腹后翻動胰腺數(shù)次，并行空腸造瘺；模型組：暴露十二指腸后，將4%牛磺膽酸鈉(1 mg/kg)逆行注入胰膽管，并行空腸造瘺術；抑制劑組：重癥胰腺炎造模成功后20 min時經(jīng)空腸造瘺管注入絲裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)抑制劑1 mg/kg,夾閉5 min。12 h后取標本進行相關指標檢測和病理檢查。

1.2Western印跡法 大鼠100 mg肺組織加入裂解液勻漿，冰上碾磨勻漿后，12 000 r/min離心10 min取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白樣品50 μg，電泳后轉膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，β-actin、p38、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、基質金屬蛋白酶(MMP)9和環(huán)氧合酶(COX)-2抗體(均購自美國Santa Cruz公司)稀釋液孵育(1∶200)，4℃過夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，洗膜后，按照ECL說明書，1∶1配置發(fā)光工作液，凝膠成像儀成像，Image J軟件進行灰度分析。

1.3HE染色 組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇處理后蘇木精液染色，75%鹽酸酒精分化30 s，酸化伊紅乙醇染色，梯度乙醇處理，二甲苯透明2 min×3次，中性樹膠封固后恒溫箱烘烤過夜，鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1肺組織濕/干重比和病理改變 模型組濕/干比重(2.932 4±0.079 6)顯著高于假手術組(0.799 1±0.069 3)，抑制劑組(1.537 8±0.071 3)顯著低于模型組(P<0.05)。模型組肺間質高度充血，絕大多數(shù)肺泡增寬，肺泡強融合成肺大泡，有一小部分萎縮，大量中性粒細胞浸潤到肺間質，小支氣管和小靜脈上皮脫落，腔內有紅細胞，抑制劑組明顯改善。

2.2肺組織p-p38、MMP9、iNOS和COX-2的表達量 與假手術組相比，模型組肺組織內p38、MMP9、iNOS、Cox-2的表達明顯升高；抑制劑組明顯降低(P<0.05，見圖1、表1)。

圖1 Western印跡檢測p-p38、MMP9、COX-2、iNOS和β-actin結果

表1 3組p38、MMP9、COX-2和iNOS灰度分析±s,n=20)

1)與假手術組相比；2)與模型組相比：均P<0.05

3 討 論

急性胰腺炎的病理過程主要是一種全身炎癥反應綜合征的發(fā)展過程，由于肺組織特殊的解剖和生理結構，是炎癥損傷最敏感的靶器官。急性胰腺炎時大量內毒素產(chǎn)生并進入血液循環(huán)系統(tǒng)，導致肺組織內的單核巨噬細胞和中性粒細胞聚集，產(chǎn)生大量的炎性介質和氧自由基，作用于肺組織和細胞，造成肺組織的炎性損傷，主要臨床表現(xiàn)為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征。在諸多炎癥介質中MMP9、iNOS和COX-2發(fā)揮重要的調控作用，以往研究證實在急性胰腺炎時，MMP9在急性胰腺炎后肺組織的表達明顯升高〔2〕，下調MMP9的表達及活性可以改善急性胰腺炎后肺組織的損傷〔3〕；iNOS的表達量明顯升高，盡管iNOS表達的上調可以補償內源性的NO不足，但是，一旦這種調控失效，NO將過量產(chǎn)生發(fā)揮氧自由基的作用，造成肺損傷，引起血壓下降甚至休克，研究證實iNOS在急性胰腺炎后的肺組織表達升高，下調其表達量可以減輕肺組織的損傷〔4〕；COX-2是一種重要的前炎癥介質，主要存在于內質網(wǎng)和核周圍，以往研究證實COX-2在基因缺陷的小鼠胰腺炎導致的肺損傷明顯減輕，使用COX-2的抑制劑可以明顯減輕胰腺炎引起的肺損害〔5〕；鑒于MMP9、iNOS和COX-2在急性胰腺時的重要性，針對一個靶蛋白的治療同時下調以上3種介質的表達可能對于胰腺炎的治療具有重要意義，而p38蛋白可能成為這樣一個候選者,研究發(fā)現(xiàn)p38對MMP9、iNOS和COX-2具有重要的調節(jié)作用〔6～8〕。

p38MAPK是一種由應激激活的蛋白激酶,分子量是由 360個氨基酸組成的38 kD蛋白,它是炎癥、應激等病理生理反應的重要參與者，這條通路調節(jié)著細胞生長、發(fā)育、細胞間功能同步及細胞周期和凋亡過程。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p38MAPK有5種異構體，并證實這些異構體之間具有不同上游激酶和下游底物選擇性〔9〕。肺組織是p38MAPK高表達的部位之一，本研究發(fā)現(xiàn)p38在急性胰腺炎大鼠肺組織的表達明顯升高，這與以往研究〔10,11〕結果相符合，同時本研究發(fā)現(xiàn)p38的選擇性抑制劑可以顯著降低p38的蛋白表達量，同時MMP9，COX-2和iNOS的表達量也明顯降低，改善預后。綜上，使用p38的選擇性抑制劑可以降低急性胰腺炎的肺損傷，為胰腺炎的臨床治療提供一定的理論基礎。

4 參考文獻

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