聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑增加雷帕霉素引起的肺癌細(xì)胞凋亡

劉 金 尤 濤 黃京子 宋 威

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院,吉林 吉林 132022)

研究顯示，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑雷帕霉素除了作為器官移植后用于臨床的免疫抑制劑作用外，也有明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用〔1，2〕。雷帕霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，白血病和肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯的抑制作用〔3，4〕。但是確切機(jī)制還不是很清楚。自噬是細(xì)胞內(nèi)降解損傷的蛋白質(zhì)的降解過(guò)程，與腫瘤存在明顯的相關(guān)性，但是自噬對(duì)化療藥物引起的凋亡的影響在不同的腫瘤細(xì)胞和不同的化療藥物中存在明顯的不同〔5〕。本文研究自噬在mTOR抑制劑雷帕霉素引起的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 雷帕霉素(Rapamycin),自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))。

1.2細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，當(dāng)A549細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 A549細(xì)胞以1×104/ml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μl，待細(xì)胞隔夜培養(yǎng)完全貼壁后給予不同的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，加入MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束后用加樣器棄除上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，孔板振蕩器上混勻10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4Western印跡檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 將各組藥物處理過(guò)的A549細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，收集到1.5 ml離心管中，裂解20 min后，離心收集上清，測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠濃度10%，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙稀(PVDF)膜上，100 V，轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉1 h。封閉結(jié)束后，加入相應(yīng)的一抗(Cell Signaling公司1∶1 000) 4℃孵育過(guò)夜，第二天加入對(duì)應(yīng)的二抗 (Cell Signaling公司1∶5 000)室溫孵育2 h，Tris鹽酸緩沖(TBST)洗3次膜，每次15 min，電化學(xué)熒光法(ECL)顯影，掃描。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Rapamycin對(duì)A549細(xì)胞生存率的影響 待A549細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，給予細(xì)胞不同濃度的Rapamycin(R)作用24 h，分為六組，對(duì)照組(Control)，Rapamycin 5 nmol/L(R 5 nmol/L),Rapamycin 10 nmol/L(R 10 nmol/L),Rapamycin 15 nmol/L (R 15 nmol/L),Rapamycin 20 nmol/L(R 20 nmol/L),Rapamycin 50 nmol/L (R 50 nmol/L)。 MTT結(jié)果顯示，Rapamycin可以明顯地引起A549細(xì)胞生存率的下降，并呈劑量依賴性，上述6組A549細(xì)胞生存率分別為1±0.11，0.88±0.09、0.71±0.08、0.57±0.07、0.50±0.09、0.41±0.07。

2.2Rapamycin對(duì)A549細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 不同濃度的Rapamycin可以明顯地引起凋亡相關(guān)蛋白酶切的Caspase-3和酶切的PARP表達(dá)水平的升高。結(jié)果提示，Rapamycin可能通過(guò)凋亡信號(hào)通路引起A549細(xì)胞生存率的下降。見(jiàn)圖1，圖2，表1。

2.3Rapamycin通過(guò)線粒體凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡 Rapamycin可以明顯地引起A549細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C表達(dá)水平的升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表1。

2.4自噬抑制劑3-MA對(duì)Rapamycin引起的A549細(xì)胞生存率下降的影響 與單獨(dú)給予Rapamycin組(0.57±0.088)相比較，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后，A549細(xì)胞的生存率(0.39±0.071)進(jìn)一步下降。Control組及3-MA組細(xì)胞生存率分別為1±0.098、0.98±0.12。

1～4:Control、10、15、20 nmol/L Rapamycin,下圖同

2.5自噬抑制劑3-MA增加Rapamycin引起的A549細(xì)胞凋亡 與單獨(dú)給予Rapamycin組相比，聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可以進(jìn)一步加劇Rapamycin引起的凋亡相關(guān)蛋白酶切的Caspase-3和酶切的PARP表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4，圖5，表2。

圖2 Rapamycin對(duì)A549細(xì)胞酶切的Caspase-3表達(dá)的影響

表1 Rapamycin對(duì)A549細(xì)胞酶切的PARP、Caspase-3及Cytochrome C表達(dá)的影響±s)

圖3 Rapamycin對(duì)A549細(xì)胞Cytochrome C表達(dá)水平的影響

1～4：Control、3-MA、Rapamycin、R+3-MA，下圖同

表2 3-MA對(duì)Rapamycin引起A549細(xì)胞酶切的PARP、Caspase-3表達(dá)水平改變影響±s)

圖5 3-MA對(duì)A549細(xì)胞酶切Caspase-3水平影響

3 討 論

引起腫瘤凋亡是目前治療腫瘤主要的策略之一，腫瘤細(xì)胞凋亡明顯快速的降低腫瘤細(xì)胞的數(shù)量同時(shí)可以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)緩慢〔6〕。化療藥物引起腫瘤細(xì)胞凋亡是目前臨床上最常用的手術(shù)輔助的治療策略，針對(duì)與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路人們研制出了多種抗腫瘤的藥物。mTOR信號(hào)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的信號(hào)通路，研究顯示mTOR信號(hào)通路與細(xì)胞周期的進(jìn)程以及細(xì)胞的增殖存在明顯的相關(guān)性，同時(shí)與腫瘤的進(jìn)程密切相關(guān)，針對(duì)于mTOR信號(hào)通路，人們研制出了多種其信號(hào)通路的抑制劑，其中Rapamycinde 研究和應(yīng)用最為廣泛〔7，8〕。Rapamycin還可以通過(guò)抑制mTOR功能引發(fā)mTOR依賴的自噬的發(fā)生。

自噬是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種膜結(jié)構(gòu)吞噬細(xì)胞內(nèi)損傷的蛋白的細(xì)胞器，最終運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的過(guò)程〔5〕。自噬與化療藥物的抗腫瘤效果密切相關(guān)，但是在不同的腫瘤細(xì)胞中和不同的化療藥物作用下，自噬發(fā)揮的作用不同。研究顯示，自噬在mTOR抑制劑Rapamycin引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡中也發(fā)揮了重要的作用〔9〕。

本文提示，mTOR抑制劑Rapamycin可以明顯地引起肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞存活率的下降以及線粒體凋亡信號(hào)通路的活化，給予自噬抑制劑可以增加凋亡的發(fā)生。聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑和mTOR抑制劑Rapamycin抑制劑可以為臨床治療肺癌提供一定的理論依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

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