梗阻性黃疸大鼠腎臟水通道蛋白2、內皮素-1表達變化

韓繼龍 王 勇 劉金鋼

(沈陽醫學院附屬第二醫院普外科，遼寧 沈陽 110002)

臨床上梗阻性黃疸病人圍術期并發癥和死亡率明顯高于無黃疸者。其突出的并發癥和重要的死亡原因就是急性腎衰竭(ARF)，發生率達8%～10%，然而死亡率卻可高達82%〔1〕。肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)作為目前臨床上檢測腎功能損害的指標，當它們增高時腎功能已受到嚴重損害，增加了臨床治療困難〔2，3〕。水通道蛋白(AQP)具有特異性強，功能專一，定位準確等特點，作為腎功能損害早期改變的研究指標是適合的〔4〕。研究發現，雖然腎臟75%的水在腎近曲小管和直小管降段重吸收，但自由水的調節卻在集合管〔5〕。所以腎臟水代謝功能受到集合管的AQP表達變化的控制〔6〕，AQP2就位于腎集合管，從而明確AQP2在梗阻性黃疸時表達變化極為重要。在梗阻性黃疸時，ARF的病理過程中，內皮素(ET)-1作為最強烈的血管收縮因子，發揮重要作用，在梗阻性黃疸時，既往實驗證實其增加并導致腎功能損害〔7〕。然而它在腎集合管表達有何變化，其表達變化是否對AQP2表達有影響尚未見報道。本實驗觀察梗阻性黃疸大鼠模型腎集合管AQP2和ET-1表達及相關性。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 雄性Wistar大鼠80只，體重250～300 g，隨機分成假手術組和梗死性黃疸(梗黃)組各40只，對應術后時間分為3、5、7、10、14 d組，每組8只。處死實驗大鼠對應術后3、5、7、10、14 d，處死前抽血化驗直接膽紅素(DBIL)、BUN、Cr。腎髓質標本取出后放在液氮中保存，然后再轉至-80℃冰箱中冷凍保存。

1.2主要試劑 AQP2一抗(兔抗鼠SA1072)、二抗(羊抗兔SA1076)；ET-1一抗(兔抗鼠SA1062)、ET-1二抗(羊抗兔SA1066)及顯色劑由武漢博士德生物制劑有限公司提供。

1.3生化檢測及病理組織形態學觀察 檢測實驗動物血標本中DBIL、BUN、Cr值。對腎髓質標本用HE染色制片，100倍光鏡觀察。

1.4免疫組織化學觀察 實驗大鼠腎髓質標本AQP2及ET-1的測定采用免疫組化ABC法。在光學顯微鏡100倍視野下，采用CMIAS圖像分析系統，每個標本隨機選取5個視野，測量其光密度(OD)值后取均數。

1.5統計學處理 應用SPSS15.0統計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1腎臟形態學改變 假手術組細胞排列規則，間質無炎性細胞浸潤。梗黃組腎臟顏色晦暗而無光澤，明顯腫脹。腎集合管上皮細胞水樣空泡變性、3 d排列不規整、腫脹、脫落，7 d還可見局灶上皮細胞壞死，14 d間質有大量炎性細胞浸潤，胞質崩解。見圖1。

2.2生化指標改變 Cr在梗黃組10、14 d時明顯高于假手術組，BUN在梗黃組14 d明顯高于假手術組，DBIL在梗黃組較假手術組明顯增高，生化指標隨梗阻時間延長呈上升趨勢(表1)。

2.3免疫組化結果 術后5 d開始梗黃組AQP2在腎集合管表達較手術組明顯減少(P<0.05)，且隨梗阻時間增加其減少。見表2。假手術組胞質褐染明顯，整個胞質均褐染。梗黃組3 d胞質褐染明顯，但較假手術組減輕。梗黃組7 d胞質褐染減輕，厚度變薄；14 d胞質褐染區明顯變小，僅少量褐染。見圖2。ET-1表達在梗阻3 d后較假手術組顯著增加(P<0.05)，且隨梗阻時間延長而增加更加明顯。見表2，圖3。

2.4梗黃組AQP2和ET-1表達相關性 AQP2與ET-1呈明顯負相關(r=-0.94,P=0.000 0)。

表1 各組血清DBIL、Cr、BUN值比較±s)

表2 各組腎集合管AQP2、ET-1的OD值比較±s)

圖1 各組腎集合管形態學(HE，×100)

圖2 各組腎集合管AQP2表達免疫組化結果(×100)

圖3 各組腎集合管ET-1表達免疫組化結果(×100)

3 討 論

梗阻性黃疸是肝外膽道及胰腺疾病常見的重要表現之一，黃疸的發生造成病人圍術期并發癥和死亡率升高。其中ARF是主要的并發癥，也是重要的死亡原因之一。臨床上反映腎功能損害的指標為Cr和BUN，而當它們發生改變時腎功能損害已較嚴重。人體內一些組織器官對于水有很強的滲透能力，人們預測在細胞膜上可能存在特殊的水通道，但直到1991年Agre等〔8〕對第一個AQP基因的cDNA分子進行克隆，并對其功能進行鑒定，其在哺乳動物的細胞膜上的存在才被證實。水主動跨膜轉運的介質為AQP〔9，10〕。由于AQP的發現，自由水的跨膜轉運問題得到了合理的解釋。它是水代謝的重要蛋白質，具有特異性強，功能專一，定位準確等特點，作為腎功能和結構損害早期改變的研究指標是適合的〔11〕。近來各種原因引起的急、慢性腎衰竭時其變化得到廣泛研究〔12〕。目前了解在腎臟中AQP有多種亞型分布。腎臟集合管主細胞管腔側和胞內囊泡內主要分布的是AQP2，成為腎臟集合管水代謝的主要載體。多種先天或后天疾病與AQP2異常有關，在尿液濃縮中對水的重吸收有重要作用〔13〕。研究梗阻性黃疸時AQP表達變化，有利于明確梗阻性黃疸時腎損傷部位、程度，還可對損傷機制進行探討。AQP2表達減少的同時發現腎集合管細胞改變，從而使腎集合管水的重吸收和尿的濃縮功能受到影響，造成腎功能損害〔14〕。在這個時期加以預防，可以大大降低梗阻性黃疸圍術期腎衰竭發生。因此AQP2可作為腎功能損害早期檢測指標〔15〕。

ET-1對腎臟水鈉調節機制仍不明確。部分學者認為：ET-1作為局部激素(腎內)的主要作用是利尿利鈉〔16，17〕。影響髓袢、集合管對尿液的濃縮功能〔18〕。研究表明在ET-1增高時，除了造成集合管細胞Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管內Ca2+增多，影響細胞代謝，加速細胞壞死以外，還影響腎小球血流動力學〔19〕。實驗證實梗阻性黃疸大鼠早期尿量增加，且其不隨入液量的減少而減少〔20〕。梗阻性黃疸早期尿濃縮功能下降的重要因素之一就是腎髓質ET-1水平的升高，使已減少的體液量進一步喪失，從而進一步加重了腎功能損害。目前還無法確定AQP2的減少就是由于ET-1的增加而導致。從ET-1的損傷機制看，由于它直接作用于腎臟集合管細胞，使其Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管內Ca2+增多，影響細胞代謝，加速細胞壞死。可能是AQP2減少的原因。可在梗阻性黃疸時阻斷ET-1的增加，從而觀察AQP2表達變化以進一步證實。

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