槲皮素對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞的影響

李恒斌 朱文博 王 冰 趙良辰

(吉林市中心醫院心內科，吉林 吉林 132011)

中藥沙棘有止咳祛痰、活血散瘀等作用，槲皮素(Que)是其主要黃酮類成分之一〔1〕。Que在心血管疾病的治療和預防方面有廣泛的應用前景，但是其對心肌纖維化的防治作用未見報道。本實驗擬觀察Que對血管緊張素(Ang)Ⅱ所致心肌細胞纖維化的抑制作用及信號傳導機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物及藥品 新出生的Wistar大鼠(SPF)，雌雄不限，購于吉林大學實驗動物中心；Que、AngⅡ、轉化生長因子(TGF)-β1購于美國Sigma公司；DMEM/F12培養基購于上?；鈱崢I有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶購于杭州四季青生物工程材料有限公司；TGF-β1 ELISA試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物購于深圳華安平康生物科技有限公司；TRIZOL reagent，M-MLV逆轉錄酶購于Invitrogen公司；羥脯氨酸試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物公司。

1.2儀器 WD-9417A酶標儀，北京市六一儀器廠；725N紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；細胞超凈工作臺，上?；巧锟萍加邢薰?；CO2培養箱， Helaeus公司。

1.3細胞分離、培養及分組 取3日齡新生Wistar乳鼠，處死后無菌條件下剪取出心室，放入D-Hanks液中清洗、剪碎，用槍吹打數次，離心5 min，棄去上清，置于37℃水浴中，加入胰蛋白酶消化10 min，10%血清終止。1 500 r/min離心5 min，取上清，細胞加入DMEM/ F12培養基中，37℃、5% CO2孵箱中培養90 min，使用差速貼壁方法將心肌細胞除去。取3～4代心肌成纖維細胞(CFB)進行實驗。取96孔板接種對數生長期細胞，基礎培養基培養24 h。棄上清，加入不同濃度的Que干預24 h，實驗分組：①對照組：完全培養基(15%胎牛血清)；②AngⅡ組：含AngⅡ10～7 μmol/L；③AngⅡ10～7 μmol/L+Que10 μmol/L組。④AngⅡ10～7 μmol/L+Que 20 μmol/L組。⑤AngⅡ10～7 μmol/L+Que 40 μmol/L組。

1.5MTT法檢測CFB增殖情況 將 CFB接種于96孔板(1×103個/孔)，每孔150 μl，培養24 h。加入各實驗組150 μl，培養24 h。加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔，孵育4 h，棄上清，加 DMSO 150 μl/孔，放置振板儀上10 min。酶標儀檢測570 nm處OD值，實驗設4復孔，取平均值。

1.6細胞上清液SOD、MDA、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、TGF-β1含量的測定 CFB培養24 h，離心，取上清，-80℃保存。比色法測定SOD、 MDA含量，測定羥脯氨酸含量反映膠原含量， ELISA法測定TGF-β1含量，全部按照試劑盒要求操作。

1.7實時聚合酶鏈反應(RT- PCR)法檢測各組細胞中Col Ⅰ、TGF-β1的mRNA表達 將CFB接種于24孔板(1×104個/孔)，加入基礎培養基，孵育24 h。加入各實驗組，培養24 h。離心，收集細胞，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，按試劑盒操作說明操作，進行PCR擴增，電泳，凝膠分析系統進行密度分析。

1.8統計學分析 使用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組CFB增殖比較 與對照組比較，AngⅡ組CFB數量明顯增加(P<0.05)；與AngⅡ組比較，Que各組CFB數量減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組CFB增殖、Col Ⅰ、TGF-β1含量、SOD、MDA水平比較±s,n=8)

2.2各組CFB培養液上清ColⅠ、TGF-β1含量比較 與對照組相比，AngⅡ組Col Ⅰ、 TGF-β1含量明顯增加(P<0.01)，與 Ang Ⅱ組比， Que各組含量降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.3各組CFB培養液上清的SOD、MDA的影響 與對照組比較，AngⅡ組SOD活性降低，MDA含量顯著增加(P<0.05，P<0.01)；而與 Ang Ⅱ組比， Que各組SOD的活性增強， Que(20，40 μmol/L)組MDA含量減少(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.4各組Col Ⅰ、TGF-β1 mRNA表達 Que組Col Ⅰ及TGF-β1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表2和圖1。

1.對照組 2.Ang Ⅱ組 3.Ang Ⅱ+Que(10 μmol/L)組 4.Ang Ⅱ+Que(20 μmol/L)組 5.Ang Ⅱ+Que(40 μmol/L)組

表2 各組ColⅠ、TGF-β1 mRNA/GAPDH的相對表達量±s,n=8)

3 討 論

心肌纖維化是由于CFB過度增殖，引起細胞間質中膠原蛋白大量積聚，含量增加，結構重排，各型膠原比例失衡，引發心臟功能異?！?〕。研究證明，心肌細胞纖維化的發生與體內氧化應激密切相關〔3〕。在氧化應激條件下，AngⅡ減少了心肌細胞自身的供氧和供血，使氧自由基和一些中間代謝產物大量堆積〔4〕。AngⅡ還可以降低體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、SOD等抗氧化系統的能力，使之清除氧自由基數量減少，破壞的代謝平衡，過多的氧自由基使心肌細胞膜中的脂質、蛋白質和 DNA出現損傷，心肌細胞變得增生肥大，引發心血管疾病〔5，6〕。本研究說明 Que抗心肌纖維化的作用可能是通過提高機體抗氧化的能力，加強清除氧自由基，降低膜脂質過氧化水平實現的。

CFB分泌的膠原是維持心臟的形態結構的主要成分，它不僅能修復損傷的心肌，而且維持著心肌舒縮能力，CFB膠原的含量標志著心肌細胞的順應能力〔7〕。Col Ⅰ占總膠原量的80%～85%，主要組成了心肌間質結構。正常生理條件下，膠原的合成受膠原基因mRNA轉錄調節，各種膠原酶調控著膠原的降解。當膠原出現代謝異常時，就會引起心肌細胞的纖維化，作為促纖維化因子TGF-β1的效應部位與Smads蛋白相結合，激活膠原基因表達，增強膠原合成〔8〕。本實驗說明Que可能是通過抑制TGF-β1的釋放而產生抗心肌細胞纖維化的作用。綜上，Que對Ang Ⅱ誘導的大鼠CFB具有抗纖維化的作用，其機制可能是通過增強機體抗氧化能力，抑制促纖維化因子 TGF-β1合成釋放來實現的。

4 參考文獻

1韋 靜，李芳耀，楊新平，等.硝酸醋類槲皮素衍生物的制備及抗氧化活性研究〔J〕. 食品工業科技，2012;33(5):95-6.

2Gajarsa JJ, Kloner RA. Left ventricular remodeling in the post-infarction heart: a review of cellular, molecular mechanisms, and therapeutic modalities〔J〕. Heart Fail Rev, 2011;16(1):13-21.

3Zamilpa R, Lindsey ML. Extracellular matrix turnover and signaling during cardiac remodeling following MI: causes and consequences〔J〕. J Mol Cell Cardiol,2010;48(3):558-63.

4van den Borne SW, Diez J, Blankesteijn WM,etal. Myocardial remodeling after infarction: the role of myofibroblasts〔J〕. Nat Rev Cardiol, 2010;7(1):30-7.

5Gao Q, Tan J, Ma P,etal. PKC alpha affects cell cycle progression and proliferation in human RPE cells through the downregulation of p27kip1〔J〕. Mol Vis,2009;15:2683-95.

6Inagaki K, Begley R, Ikeno F,etal. Cardioprotection byepsilon-protein kinase C activation from ischemia: continuous delivery and antiarrhythmic effect of an epsilon-protein kinase C-activating peptide 〔J〕.Circulation,2005;111(1):44-50.

7Sakai H, Urasawa K, Oyama N,etal. Induction of c-fos mRNA expression by pure pressure overload in cultured cardiac myocytes〔J〕.Int Heart J,2007;48(3):359-67.

8Nakagami H, Takemoto M, Liao JK. NADPH oxidase-derived superoxide anion mediates angiotensin II-induced cardiac hypertrophy〔J〕.J Mol Cell Cardio1,2003;35(7):851.