eNOS、ACE基因多態性與代謝綜合征的相關性

劉 丹 胡 松 趙吉順 尹燕鳳 毛擁軍

(山東外貿職業學院，山東 青島 266000)

代謝綜合征(MS)是一組以代謝紊亂為主要特征的癥候群，主要表現：腹型(或內臟型)肥胖、胰島素抵抗(葡萄糖耐受不良)、特征性血脂異常〔低高密度脂蛋白(HDL-C)血癥，高甘油三酯(TG)血癥〕、高尿酸(UA)血癥、高血壓。其中，高血壓是MS最典型特征，據報道超過1/3高血壓患者罹患有MS〔1〕。高血壓已經成為MS患者逐漸增加的心血管事件的獨立危險因素〔2〕，是血壓平穩MS患者的2倍〔3〕。遺傳學的進步，人們發現許多疾病的機制由多個基因和信號通路參與并相互作用；隨著基因圖譜的完成，運用遺傳學探討疾病的發病機制與流行病學特征成為可能。本研究通過基因芯片技術檢測eNOS(G894T)基因多態性與ACE(D/I)多態性，評估基因多態性與老年原發性高血壓患者MS的相關性。

1 對象與方法

1.1入選標準及排除標準 入選標準：2010年1月至2012年6月,于青島大學醫學院附屬醫院特需保健科就診，60歲以上的原發性高血壓患者。排除標準：排除繼發性高血壓、嚴重心腦血管疾病、心功能Ⅲ～Ⅳ級(NYHA分級)、左室射血分數(LVEF)<50%、心臟瓣膜病、肝腎衰竭、惡性腫瘤。根據標準入選368例，均告知研究方法及意義，簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料 收集入選對象既往史、個人史、用藥史以及社會學特征；測量身高、體重、腹圍，留取尿液及空腹12 h靜脈血。安靜環境中靜息30 min以上，水銀血壓計測右上臂血壓，取3次非同日血壓的均值。參照2007年《中國成人血脂異常防治指南》〔4〕，以下標準符合3條或更多診斷為MS：血壓≥130/85 mmHg；向心性肥胖：腰圍>90 cm(男)，85 cm(女)；TG≥1.7 mmol/L；HDL-C≤1.04 mmol/L；空腹血糖≥6.1 mmol/L，糖負荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L或有糖尿病史。

1.2.2超聲心動圖檢查 均行彩色多普勒心臟超聲檢查。參照美國心臟超聲協會推薦方法，測取標準左心室長軸切面M型超聲連續的3個心動周期，測量左室舒張末期內徑(LVDd)，左室后壁厚度(LVPWT)，舒張期室間隔厚度(IVST)。根據數值計算左室重量指數(LVMI)〔5〕。

1.3標本制備 取肘靜脈血2～3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，充分混勻。

1.4儀器設備 BaiO-BE系列基因芯片檢測儀(上海百傲科技有限公司)，BE-2.0生物芯片識讀儀，離心機TGL-16B，PCR擴增儀TC-25/H，分光光度計，電泳槽，恒溫培養箱DHP030，微量移液器，水浴鍋，打印機等。

1.5內皮素-2 A894G基因多態性測定 取靜脈血，分離白細胞，提取DNA。留取肘靜脈血約3～5 ml，EDTA 50 μl抗凝處理。低滲法裂解紅細胞分離得到白細胞。飽和酚/氯仿法由白細胞中提取基因組DNA，加入TE溶解DNA，-20℃保存。將DNA溶解至蒸餾水中與單純蒸餾水作為空白對照，紫外分光光度計檢驗DNA的純度。聚合酶鏈式反應擴增ET-2基因的特異片段(反應體系為25 μl)。反應條件：94℃熱啟動5 min，94℃變性25 s，56℃退火25 s，72℃延伸25 s，反復40個循環，72℃延伸5 min，最后冷卻至4℃。將雜交倉中的基因芯片與PCR擴增產物混勻雜交，加入顯色溶液，置于BaiO基因生物芯片識讀儀檢測，圖像Array Doctor軟件自動分析生成結果，檢測eNOS(G894T)多態性與ACE(D/I)多態性。

1.6統計學方法 評估基因分布是否符合HarDY-Weinberg平衡。采用SPSS15.0軟件進行t、χ2檢驗、協方差分析及Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1基線特征 MS(+)組與MS(-)組相比，年齡、體質指數(BMI)、腰臀比(WHR)、血糖、LVMI差異顯著(P<0.05)。性別、脈壓、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、UA無差異(P>0.05)(表1)。

2.2基因型及等位基因的頻率分布及關聯性分析 eNOS(G894T)基因多態性與ACE(D/I)多態性基因多態性分布符合HarDY-Weinberg平衡，樣本具有群體代表性。分析MS(+)組與MS(-)組eNOS基因多態性與ACE多態性的差異(表2)。χ2檢驗后顯示：MS(+)與MS(-)相比，eNOS基因G/G與G/T+T/T分布差異具有統計學意義(P<0.05)；eNOS、ACE基因型分布無顯著差異(P>0.05)，eNOS基因型G/G+G/T與T/T分布無顯著差異，eNOS等位基因G、T，ACE等位基因D、I分布無顯著差異。

表1 基本資料比較

表2 基因型頻率分布(n)

2.3協方差檢驗 檢驗正態分布和方差齊性后，定義協變量為性別、年齡、性別、BMI、WHR、SBP、DBP、TG、TC、HDL-C、LDL-C、LVMI，兩組基因的優勢基因型為因變量，MS為分組變量，檢驗各組協變量與因變量的總體回歸系數相同且不為0后，進行檢驗。結果顯示： eNOS(G894T)基因型T/T與MS無明顯相關(P=0.293)，ACE(D/I)基因型D/D與MS相關(P=0.032)。MS(+)組ACE基因型D/D協方差95%CI為1.645～1.781；MS(-)組95%CI為1.758～1.900。采用獨立樣本t檢驗分析兩組不同基因型對參數的影響(表3)。結果顯示：eNOS基因型T/T與G/T+T/T相比，年齡、UA差異具有統計學意義(P<0.05)；ACE組基因型D/D與D/I+I/I相比，WHR、LVMI差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4二分類Logistic回歸分析 將MS有無定義為因變量，將年齡、性別、生化指標、既往病史等影響因素及兩組基因優勢基因型定義為自變量，進行二分類Logistic回歸分析(表4)。MS(+)與MS(-)相比，BMI、WHR、LVMI、ACE基因型DD為MS危險因素(P<0.05)。BMI：OR=1.327，95%CI：1.151～1.531；WHR：OR=12.936，95%CI：1.704～98.218；LVMI：OR=1.417，95%CI：1.398～2.426；ACE基因型D/D：OR=2.017，95%CI：1.107～3.675。

表3 不同基因型各參數比較

表4 二分類Logistic回歸分析

3 討 論

MS患者發生心肌梗死或腦卒中的概率是正常人的3倍；死亡率則是正常人的2倍〔5〕。關于MS的分子生物學機制、基因調控及信號轉導通路仍未完全明確，但已有研究證實MS的相關機制，并同時證明了MS與心肌肥厚之間的關聯性。

氧化應激反應及內皮功能障礙。近期研究發現：MS促進氧化應激發生，并與鈉潴留及鹽敏感性緊密相關〔6〕。內皮功能障礙與胰島素抵抗的相互關系已得到大型流行病學研究支持〔7〕：胰島素抵抗通過抑制細胞內磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)相關信號通路，使內皮系統NO的產生與內皮素-1(ET-1)分泌失衡，從而導致內皮功能障礙。動物實驗發現：IGF1-PI3K(p110α)-Akt 信號通路參與調節心肌生長。胰島素生長因子(IGF1)主要由肝臟分泌，參與胎兒生長及發育；心肌細胞同樣分泌IGF1，并與其相應的細胞表面受體IGF1R相連。基因定向小鼠實驗〔8〕證實：IGF1參與心肌細胞的生長，主要表現為心肌數量的增加；IGF1激活PI3K(p110α與Akt)，進而誘導心肌細胞增大；IGF1R轉基因小鼠心肌內，PI3K的激活及Akt磷酸化作用顯著提高。內皮細胞中，無生物活性的eNOS儲存在微囊蛋白1(Cav-1)內，在磷酸化活躍的部位分解釋放有活性的eNOS，從而調節NO的合成〔9〕。以前研究認為eNOS內含天冬氨酸殘基，致使eNOS功能障礙，而最近研究證實eNOS基因型T/T的人群相較基因型G/G更容易出現eNOS合成失調。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)激活。實驗研究發現：RAS受內分泌及食物攝取情況調節，食物的過度攝取導致脂肪組織內血管及張素Ⅱ(AngⅡ)水平顯著升高。同樣，脂肪細胞內血管緊張素原(Ang)及AngⅡ的大量產生可能增加肥胖、高血壓的發生率〔10〕。資料顯示，血管壁肌層內，AngⅡ通過血管緊張素受體-1(AT1)干擾PI3K及Akt信號通路，進而干擾胰島素信號，抑制胰島素的功能〔11〕；細胞因子RhoA的活性與氧化性應激通過抑制PI3K/Akt通路、減少NO的生成參與介導這一過程〔1〕。近期研究顯示〔5〕：ACE基因D等位基因可能為MS的危險因素。

本研究通過流行病學調查發現：ACE基因型DD與MS相關；但未證實eNOS基因型與MS的相關性；MS(+)組與MS(-)組之間兩組基因等位基因的Pearsonχ2檢驗無顯著差異。上述結果與相關研究結論不符，考慮原因可能與地區差異及樣本量較小有關。認為ACE基因型DD亦可能為心肌肥厚指標LVMI的危險因素。本研究系回顧性研究，較前瞻性研究具有局限性，樣本量偏小，難以避免選擇性偏倚；有待大樣本研究進一步證實。

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