亞硒酸鈉預處理對Aβ損傷PC12細胞的保護性作用

王敏娟 李亞軍 張 蓓 石少亭 郭長江 折 瀟 張世俊 左 星

(西安醫學院第一附屬醫院神經內科，陜西 西安 710077)

阿爾茨海默病(AD)病理變化之一是淀粉樣蛋白前體(APP)裂解成的β淀粉樣蛋白沉積腦內所形成的老年斑及神經元纖維纏結。AD的發病機制非常復雜，氧化應激被認為是AD的一個重要致病因素，有研究表明，由異常沉積Aβ誘導的氧化應激導致的神經元代謝障礙和突觸功能喪失在AD發病中處于關鍵地位〔1，2〕。增強其抗氧化能力變成了近年來AD治療的一個靶點。腦內主要的抗氧化含硒酶是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，GSH-Px通過活性中心的硒代半胱氨酸與氧代謝產物發生接觸反應，發揮其抗氧化功能，研究表明硒能夠增強GSH-Px的抗氧化活性。本研究觀察亞硒酸鈉預處理對Aβ氧化損傷PC12細胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細胞株、亞硒酸鈉(購自西安交通大學醫學院中心實驗室)；Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、Aβ1～40；二甲基亞砜(DMSO美國Sigma公司)。LDH、GSH-Px、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；碘化丙啶(PI)、FITC-Annexin V(美國Sigma公司)；其余試劑為國產分析純試劑。

1.2主要儀器設備 Thermo Forma CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific)；POLARstar OPTIMA酶標儀(德國BMGLABTECH實驗儀器公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(天津泰斯特儀器有限公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 PC12細胞用含10%的小牛血清的DMEM培養基(100 mg/L鏈霉素，100 mg/L青霉素)在37℃、5%的CO2及飽和濕度的培養箱中培養，每2～3天換液一次，5～6 d傳代一次。

1.3.2MTT法檢測亞硒酸鈉對PC12細胞活性的影響 選擇對數生長期的PC12細胞，胰酶消化后細胞計數，調整細胞密度為1×105接種到96孔板上，待其貼壁后，在各組中加入亞硒酸鈉，使其終濃度為0、0.5、1、5、8、10、20、50、150 mg/L，總體積為200 μl，每組設6個復孔，培養44 h后，每孔內加入MTT 20 μl，繼續孵育4 h，然后吸去上清液，每孔內加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使紫藍色結晶充分溶解。用酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。

1.3.3分組 分為正常對照組、亞硒酸鈉預處理組、亞硒酸鈉預處理后損傷組、損傷組。正常對照組：PC12細胞培養72 h。亞硒酸鈉預處理組：PC12細胞加入含有亞硒酸鈉(終濃度0.5 mg/L)培養基培養48 h后，更換為完全培養基培養。預處理后損傷組：PC12細胞加入含有亞硒酸鈉(終濃度0.5 mg/L)培養基培養48 h后，更換為含有Aβ的培養基(終濃度25 μmol/L)培養24 h。損傷組：PC12細胞培養48 h后加入含有Aβ的完全培養基(終濃度25 μmol/L)培養24 h。

1.3.4MTT法測定各組細胞的生存率 選擇對數生長期的PC12細胞，分組處理方法同上，用MTT法(同上)檢測各孔吸光度(OD)值。

1.3.5流式細胞儀檢測凋亡 選擇對數生長期的PC12細胞，分組處理方法同上，胰酶消化并收集各組細胞于10 ml離心管中，1000 r/min，離心5 min，棄去培養液，用PBS再洗滌兩遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用100 μl的標記溶液(標記液：將FITC-Annexin V和PI加入到孵育緩沖液即10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2中，終濃度均為1 mg/L)重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動，做流式細胞儀分析。

1.3.6MDA含量測定 過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸結合，形成紅色產物，在532 mm處比色測定各管吸光度，通過公式計算可求出被測樣品中的MDA含量。測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.7GSH-Px活性及LDH漏出率測定 測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計學軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1亞硒酸鈉對PC12細胞的影響 當亞硒酸鈉濃度為0.5 mg/L時，處理細胞24 h后，其OD值為0.80±0.11，與正常對照組比較無統計學意義(0.812 4±0.145 0，P>0.05)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加(1，2，5，8，10，20，50 mg/L)，各組細胞的OD值也越來越小(0.775 0±0.176 5,0.720 0±0.239 4,0.483 3±0.306 2,0.330 0±0.258 2,0.261 7±0.174 0,0.210 0±0.143 8,0.131 7±0.098 0)，與正常對照組比較有統計學意義(P<0.05)，當濃度為150 mg/L時，細胞的OD值接近于零(0.108 3±0.204 0)。

2.2亞硒酸鈉對Aβ損傷PC12細胞的保護作用

2.2.1細胞形態學觀察 正常對照組PC12細胞的形態完整規則，細胞呈梭形有立體感；亞硒酸鈉預處理后的PC12細胞體積增大，形態豐滿，胞核大，胞質豐富；Aβ損傷PC12細胞24 h后細胞的密度下降，融匯成片，細胞間空隙增大，形態有所改變，突起縮短甚至消失，大部分細胞呈球形，有活力細胞數目減少，胞質較暗淡，貼壁細胞欠透明；亞硒酸鈉預處理后經Aβ損傷的PC12細胞與損傷組比較，分布較均勻，未見匯聚成片，可見細胞突起，細胞形態較規則完整(圖1)。

正常對照組 亞硒酸鈉預處理組 損傷組 預處理后損傷組

2.2.2MTT結果 亞硒酸鈉預處理組細胞的OD值(1.04±0.09)較正常對照組(0.89±0.08)增高(P<0.05)，損傷組細胞的OD值(0.41±0.05)較正常對照組下降(P<0.01)，預處理后損傷組細胞的OD值(0.66±0.05)較損傷組增高(P<0.01)。

2.2.3流式細胞儀檢測凋亡 預處理后損傷組與損傷組相比，細胞的早期和晚期凋亡率均降低(P<0.05)。見表1。

2.3GSH-Px活性測定 損傷組GSH-Px活性較正常對照組下降(P<0.01)，亞硒酸鈉預處理組GSH-Px活性較正常對照組顯著增高(P<0.01)，而預處理后損傷組GSH-Px活性較損傷組增高(P<0.01)。各組細胞相比亞硒酸鈉預處理組GSH-Px活性最高，損傷組GSH-Px活性最低，預處理后損傷組GSH-Px活性較損傷組增高。見表2。

表1 亞硒酸鈉對Aβ氧化損傷PC12細胞凋亡率的影響

表2 亞硒酸鈉對Aβ氧化損傷PC12細胞各指標影響

2.4MDA含量、LDH漏出率測定 損傷組的MDA含量較正常對照組增高(P<0.01)，而預處理后損傷組較損傷組的MDA含量下降(P<0.05)。損傷組的LDH漏出率較正常對照組增高(P<0.01)，而預處理后損傷組較損傷組的LDH漏出率下降(P<0.01)。見表2。

3 討 論

AD臨床主要表現為進行性認知功能損害，精神行為癥狀和社會生活功能減退〔3〕。據統計，2006年，AD在全球的發病率就達到了2 655萬〔4〕，占了所有癡呆病例的50%～60%。本病最具特征性的病理改變為神經細胞外老年斑和細胞內神經元纖維纏結的形成。老年斑的主要成分是Aβ蛋白，Aβ蛋白在神經細胞外積聚，通過誘導氧化應激等多種方式對神經細胞造成損傷，最終導致神經細胞破裂而死亡。主要的損傷途徑如下：①Aβ聚集可以產生大量自由基，破壞細胞膜的完整性，干擾細胞內離子穩態而誘導神經細胞凋亡；②Aβ與特異性的受體相結合激活膠質細胞產生腫瘤壞死因子等毒性物質而導致神經元死亡；③Aβ產生的脂質過氧化物介導細胞損傷，抑制再生〔5，6〕。④Aβ與Cu2+、Zn2+等氧化型的金屬離子結合成復合物催化ROS生成。⑤AD早期Aβ即可進入線粒體與ABAD、CYPD等靶點結合誘導神經元細胞的凋亡〔7,8〕。有關動物實驗表明過度表達Aβ的轉基因小鼠出現與AD患者相似的氧化應激損傷〔9〕，本研究使用Aβ作用于PC12細胞來模擬AD的體外發病模型，Aβ損傷組細胞的密度下降，部分細胞死亡，凋亡細胞增加，大部分細胞形態改變，LDH漏出率增加，同時該組細胞的抗氧化能力下降，表現為GSH-Px活性下降，并且脂質過氧化物MDA的含量增加，這與AD的氧化應激發病機制是一致的，即抗氧化能力減弱的同時自由基生成增加。此外，有研究表明AD患者的血清甲狀腺素水平顯著低于正常人群〔10〕，這可能也與氧化應激有關。

大量證據顯示氧化應激不僅是AD的早期事件,而且還激活特定的信號轉導通路引起級聯酶促反應〔1,11～15〕，它在AD的發病機制中處于關鍵的地位，因此針對抗氧化應激的治療也受到極大關注。GSH-Px在機體的抗氧化防御體系中擔任重要角色，它與體內的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)一起構成了機體的抗氧化防御體系。GSH-Px可以消除機體內的過氧化氫及脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，是生物體內重要的活性氧自由基清除劑，它以Sec的形式發揮作用，以谷胱甘肽(GSH)為還原劑分解體內的脂質過氧化物，因而可防止細胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷。GSH-Px是腦內主要的抗氧化酶，活性中心Sec被氧化成為半胱次磺酸或二硫化物，后者再被硫氧還蛋白還原酶還原成半胱氨酸從而恢復GSH-Px的抗氧化活性。有研究發現，氧化應激可以使GSH-Px的Sec被氧化為亞磺酸甚至磺酸，該產物不能在硫氧還蛋白還原酶作用下還原為GSH-Px〔16〕，這意味著氧化應激直接導致了GSH-Px的數量減少、活性下降。因此維持GSH-Px在腦內的含量和活性，在腦的抗氧化損傷中具有非常重要的意義。Aβ蛋白通過誘導氧化應激對神經細胞造成損傷，最終導致神經細胞破裂而死亡，那么誘導細胞產生更多的GSH-Px是否能夠改善AD的癡呆癥狀、延緩神經功能的減退尚有待于進一步證實。目前，項長達5～12年PREADVISE研究將揭示硒對AD的保護效應。

本研究使用亞硒酸鈉預處理PC12細胞，發現低濃度的亞硒酸鈉可以促進細胞增殖，使細胞的存活率增加，細胞的突起延長，同時預處理組GSH-Px活性明顯增強，分析原因可能是一方面亞硒酸鈉通過強化神經生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)等因子表達，促進細胞生長發育與分化，使細胞的存活率增加，同時亞硒酸鈉增強GSH-Px的表達最終提高了GSH-Px活性。經過亞硒酸鈉預處理后的PC12細胞抵抗Aβ誘導的氧化損傷能力增強，與損傷組相比可見亞硒酸鈉預處理組細胞形態規則完整，分布較均勻，可見細胞突起；細胞的存活率增高；凋亡率、LDH漏出率、MDA含量下降；GSH-Px活性消耗減少。因此，本研究認為亞硒酸鈉可以誘導PC12細胞產生更多的GSH-Px，促進細胞增殖，增強細胞抵抗Aβ誘導的氧化應激的能力，對改善AD的癡呆癥狀、延緩神經功能的減退可能有一定的作用。

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