姜黃素聯合奧沙利鉑對人胃癌BGC-823細胞的作用

韓金榮 羅 強 劉 華 孫 黎 張林西

(河北北方學院生命科學研究中心，河北 張家口 075000)

姜黃素的多種藥理活性與其抗氧化、抗炎作用有關〔1〕。目前已有實驗證實姜黃素對多種腫瘤細胞具有抑制生長和誘導凋亡的作用，其抗腫瘤機制各不相同〔2〕。奧沙利鉑(L-OHP)為第三代鉑類化合物，是消化系統(tǒng)腫瘤化療方案中的常用藥物。本研究旨在探討姜黃素聯合L-OHP對L-OHP殺傷胃癌細胞的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 姜黃素購于天津市科密歐化學試劑有限公司；奧沙利鉑由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品；Caspase-3活性檢測試劑盒、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、FITC標記山羊抗兔二抗購自碧云天生物技術研究所；兔抗人FAS一抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；人胃癌BGC-823細胞為河北北方學院生命科學研究中心保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將BGC-823細胞接種于培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數生長期細胞用于本實驗。

1.2.2細胞生長抑制試驗(CCK-8法) 取5×104/ml 的細胞懸液接種于96孔板中，按陰性對照組、姜黃素組、奧沙利鉑組、聯合作用組，分別來加藥物。每個組的濃度設4個復孔。培養(yǎng)箱中再孵育24 h后，每孔加入20 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育4 h，酶標儀檢測各孔在490 nm處的光吸收值(A490值)，按照公式計算抑制率。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集對數生長期細胞，離心計數，調整細胞濃度為5×105/ml，每孔2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入藥物。陰性對照組加入完全培養(yǎng)基2 000 μl，姜黃素組終濃度20 μmol/L，奧沙利鉑組終濃度為10 μmol/L，聯合作用組姜黃素和奧沙利鉑的濃度分別為20、10 μmol/L，設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化后離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖(PBS)液輕輕重懸細胞并計數。取1×106個重懸細胞，離心棄上清后加入195 μl Annexin V-FITC結合液，5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，離心棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結合液、10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.4流式細胞儀檢測Fas在細胞中的表達 收集對數生長期細胞，離心計數，取5×105/ml的細胞懸液按每孔2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加藥和分組同流式細胞術檢測細胞凋亡率。設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS液洗滌2次，加入1∶100稀釋的一抗100 μl，在37℃恒溫水浴中溫育30 min，PBS液洗滌2次，然后加入1∶20稀釋的FITC標記的二抗100 μl，37℃水浴30 min，PBS洗滌2次，除去未結合的熒光抗體。加入1 ml PBS，將樣品上機進行測定Fas蛋白。

1.2.5分光度法檢測Caspase-3 酶活性 收集對數生長期細胞，制成1×107/ml的細胞懸液，每孔2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入藥物。進一步操作同上，再次培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集細胞。冰浴裂解后，按Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定pNA標準曲線和檢測Caspase-3酶活性，重復3次。

2 結 果

2.1細胞生長抑制試驗 2.5,5.0,10,20,40 μmol/L 5個不同濃度的姜黃素作用BGC-823細胞24h，對BGC-823細胞增殖均能明顯的抑制，抑制率分別為(7.38±0.14)%，(11.02±0.17)%，(18.89±0.15)%，(34.92±0.18)%，(39.84±0.29)%。1.25,2.5,5,10,20 μmol/L 5個不同濃度的奧沙利鉑作用BGC-823細胞24 h，對BGC-823細胞的抑制率分別為(6.41±0.12)%，(12.61±0.15)%，(22.74±0.25)%，(27.84±0.28)%，(42.03±0.31)%。姜黃素和奧沙利鉑二者聯合作用于BGC-823細胞24 h，對BGC-823細胞的抑制率分別為(14.05±0.21)%，(22.79±0.23)%，(40.15±0.32)%，(57.80±0.27)%，(70.79±0.39)%。上述結果顯示，姜黃素和奧沙利鉑單用及聯合作用時均能夠抑制BGC-823細胞的增殖，且呈現出明顯的劑量依賴性。聯合作用組的抑制率顯著高于單獨用藥組(均P<0.01)。

2.2流式細胞術檢測細胞凋亡率 姜黃素組、奧沙利鉑組、聯合作用組細胞凋亡率分別為(25.87±4.41)%、(26.93±4.40)%、(62.63±1.90)%與陰性對照組(2.17±0.25)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

2.3姜黃素和奧沙利鉑對細胞凋亡相關基因Fas蛋白表達的影響 姜黃素和奧沙利鉑均能增加Fas基因的表達，且聯合作用組明顯高于單藥組，與對照組表達率比較差異顯著(P<0.01)。見表1。

2.4Caspase-3活性變化 姜黃素組、奧沙利鉑組中Caspase-3活性的相對值，與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。聯合作用組Caspase-3活性的相對值，明顯高于陰性對照組、姜黃素組、奧沙利鉑組(P均<0.01)。見表1。

表1 姜黃素和奧沙利鉑作用24 h后胃癌BGC823細胞中Fas表達和Caspase-3活性的變化

3 討 論

姜黃素是從姜科植物姜黃地下根莖中分離出來的具有廣泛生物活性的物質，由于其明顯的抗腫瘤特性，美國國立腫瘤研究所將其定為第三代癌化療預防藥〔3〕。奧沙利鉑作為第三代鉑類抗腫瘤藥物，臨床應用廣泛。

胃癌是常見的消化道腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細胞異常分化、過度增殖有關，而且與細胞凋亡減少有關，故誘導腫瘤細胞凋亡將成為腫瘤治療的新途徑〔4〕。

細胞凋亡的發(fā)生，通過一種內源性途徑(也稱為線粒體途徑)和外源性途徑(又稱死亡受體途徑)〔5〕。最重要的配體死亡受體系統(tǒng)包括腫瘤壞死因子(TNF)，腫瘤壞死因子受體-1，Fas-L的Fas(也稱為CD95或Apo1)和TRAIL的TRAIL受體〔6〕。Fas和Fas-L的結合導致Fas相關死亡域(FADD)的寡聚受體與FADD形成死亡誘導信號復合物，這引發(fā)半胱氨酸蛋白酶結合，從而Caspase的級聯活化，Caspase-3的活化，從而導致細胞凋亡〔7〕。Fas/Fas-L在胃癌和結腸腫瘤中均有表達〔8〕。因此，Fas/Fas-L系統(tǒng)是細胞凋亡的一個重要環(huán)節(jié)。

本實驗發(fā)現在BGC-823細胞中姜黃素和奧沙利鉑激活了Fas的表達，Fas表達增加能夠促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。季宇彬等〔9〕在萊菔硫烷誘導人肝癌于HepG2細胞凋亡中報道與此一致。同時本研究發(fā)現，姜黃素和奧沙利鉑誘導BGC823細胞凋亡的過程中Caspase-3的活性也升高，這與曾呈軍等〔10〕在胃癌和楊春梅等〔11〕在結腸癌中的報道相類似。張靜等〔12〕也發(fā)現姜黃素可能通過激活Caspase-3誘導人肺腺癌細胞A549凋亡。Fas與Fas-L結合后，通過FADD的介導將凋亡信號傳遞給Caspase-8，激活Caspase-8產生一種連鎖反應，導致Caspase-3的活化，產生死亡效應分子，誘導細胞凋亡。本研究提示上調Fas的表達，活化Caspase-3的活性，是姜黃素和奧沙利鉑抑制胃癌BGC823細胞凋亡的重要機制之一。

姜黃素作為抗瘤新藥毒性低、耐受性好、成本低廉，其與奧沙利鉑的聯合應用為腫瘤的化療，可以使化療毒副作用明顯減少，治療有效率提高，降低耐藥性。

4 參考文獻

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12張 靜,連超群,陳傳好,等.姜黃素誘導A549細胞凋亡過程中活性氧水平和Caspase-3活性的變化〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(11):2024-6.