HCCR、pERK及pELK1蛋白在胃癌組織中的表達及其相關性

姚林華　胡奕　鄧中民　張玲　張國新

[摘要] 目的 檢查胃癌組織及癌旁組織中HCCR、pERK及pELK1的表達，探討之間的相關性。 方法 通過免疫組化方法檢測60例胃癌及癌旁組織中HCCR、pERK及pELK1的表達情況。 結果 HCCR、pERK及pELK1在胃癌組織中的陽性表達率分別為75.0%（45/60）、73.3% （44/60）及71.7%（43/60），均高于其在癌旁組織中的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 HCCR、pERK及 pELK1三者之間具有一定的協(xié)調(diào)表達率，在腫瘤組織中表達明顯增高，可用來作為胃癌臨床免疫組化的輔助指標。

[關鍵詞] 胃癌；HCCR；pERK；pELK1

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）24-0001-03

韓國學者KIM首先在人宮頸癌中發(fā)現(xiàn)了人宮頸癌基因（human cervical cancer oncogene，HCCR），并在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)在多系統(tǒng)腫瘤中都有過表達，比如消化系統(tǒng)腫瘤、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤等，人惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展被認為有多種機制參與，而癌基因在其中作用較大，相關研究發(fā)現(xiàn)HCCR在消化系統(tǒng)腫瘤中的早期肝癌及乳腺癌中高表達[1]。那么研究HCCR在腫瘤細胞中的信號表達調(diào)控則非常重要，ERK/MAPK信號通路是目前較為常見的腫瘤調(diào)控通路，此次檢測HCCR、pERK及pELK1相關蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達，初步評價三者之間是否存在相關性，為更好的研究HCCR表達調(diào)控打好基礎。

1 資料與方法

1.1試劑

鼠抗人pERK、pELK1：Cellsiganal公司；鼠抗人HCCR多抗：本實驗制備[2]；免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。

1.2 組織標本

所需組織標本取自2008年12月～2011年9月在南京醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，共60例胃癌組織及其相應的癌旁組織，所有組織經(jīng)病理證實為胃癌及癌旁未浸潤，年齡39～81歲，平均（61.2±5.7）歲。所有標本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。

1.3方法

采用免疫組織化學染色SP法，將切好的組織芯片放置在60℃烘烤箱中，使切片緊密結合，約30 min后進行第二步常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%過氧化氫37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；后在壓力鍋中加熱至沸騰0.01M檸檬酸鹽緩沖液，以便抗原修復組織芯片，加熱使噴氣持續(xù)2 min，后自然冷卻組織芯片，并達20 min 以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。PBS洗3次，每次放置5 min，后放置4℃孵育一抗過夜，鼠抗HCCR（1∶100）、兔抗pERK及pELK1（1∶100），PBS代替一抗作陰性對照；按照免疫組化SP法完善余下操作。DAB顯色5 min左右，三類附有不同一抗的組織芯片在顯微鏡下掌握染色程度，按照不同的DAB染色時間分別用水沖洗終止顯色，并使用蘇木素復染15 s，加入0.1%鹽酸分化。梯度酒精脫水之后，透明，封片，拍照。結果判斷：依照細胞陽性著色程度（抗原含量）可分為：弱陽性（+）為1分；中等陽性（++）為2分；強陽性（+++）為3分。依照陽性細胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+），指陽性細胞總數(shù)25%以下；中等陽性（++），指陽性細胞總數(shù)25%～49%；強陽性（+++） ，指陽性細胞總數(shù)50%以上。采用積分綜合計量，計算公式為：（+）%×1 +（++）%×2+（+++）%×3；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0～1.5者為（++），>1.5者為（+++）。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.1軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示；計數(shù)資料用率表示，組間比較用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCCR、pERK及pELK1蛋白在胃癌組織中的表達

HCCR、pERK及pELK1陽性表達主要位于細胞胞膜和胞漿（圖1）。HCCR在胃癌組織中陽性表達率為75.0%（45/60），而pERK及pELK1陽性表達率分別為73.3%（44/60）及71.7%（43/60），HCCR的表達略高于另外兩項，三者均高于在癌旁組織中的表達（P<0.05）。見表1。

2.2 HCCR、pERK及pELK1表達與患者的臨床特點分析

研究發(fā)現(xiàn)入組的胃癌患者中男性明顯多于女性，但pELK1、HCCR、pERK表達與性別無明顯統(tǒng)計學差異。患者的年齡、淋巴結轉移與否、腫瘤細胞的分化程度與三種蛋白的表達陽性率無明顯差異（表2），三種蛋白在腫瘤中同時陽性表達為53.33%（32/60），提示三者之間具有一定程度的協(xié)同表達。

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤，目前在各種腫瘤中發(fā)病率最高，尤其在我國西北及東部地區(qū)，一般發(fā)病年齡在50歲以上，但有年輕化的趨勢，所以研究胃癌的發(fā)病機制，特別是胃癌的早期階段特異性指標非常重要。HCCR是新近發(fā)現(xiàn)的原癌基因之一，它因首先在人宮頸癌中發(fā)現(xiàn)而得名，定位于人染色體12q，其分為HCCR-1和HCCR-2兩種亞型。對于基因的研究主要涉及在腫瘤組織及腫瘤細胞的表達，對于該基因的功能學特點等方面。對HCCR基因序列的研究發(fā)現(xiàn)在啟動子區(qū)有多個轉錄因子結合區(qū)，比如E2F、ELK1、Barx等，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)EGF能夠使腫瘤細胞中HCCR表達增強，如在胰腺腫瘤細胞中，EGF通過p13K/Akt/mTOR激活HCCR表達，使腫瘤細胞的生物學活性增強，而腫瘤細胞的生物學功能亦加強[3]。而在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)，HCCR可以增強腫瘤細胞的增殖及細胞分裂，并且也是通過p13K/Akt通路[4]。一般目前認為腫瘤細胞的應答機制較復雜，往往有幾條通路參與，并都占有一定的地位，而且往往不同腫瘤細胞的發(fā)生機制亦有差別，對于EGF促進腫瘤細胞的生物學研究較多，比較經(jīng)典的有ERK（p42/p44 MAPK）信號通路。ERK（p42/p44 MAPK）信號通路要通過幾種方式傳導：①Ras的激活[5]；②Ca2+對受體酪氨酸激酶Ras的激活[6]；③蛋白激酶C對ERK通路的活化[7]；④G蛋白對ERK的激活[8]，ERK1傳導引起細胞分化及增殖的信號。

HCCR過表達能夠抑制P53基因功能的表達，從而達到致腫瘤效應，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HCCR綁定蛋白3能夠負向調(diào)節(jié)p21及Bax，從而影響p53的功能[9]。在早期小細胞肝癌（直徑<2 cm）的診斷上，目前臨床上常規(guī)的檢查方法具有一定的局限性，往往造成檢出率較低，而腫瘤的治療關鍵在于早期診斷，早期治療，通過使用HCCR與AFP聯(lián)合檢測可以大幅度的提高早期小細胞肝癌的檢出率[10]。在食管癌的檢測中發(fā)現(xiàn)，HCCR在腫瘤組織中高表達，生存期的分析發(fā)現(xiàn)，HCCR高表達的食管癌患者預后較低表達的患者差，提示HCCR可作為食管癌患者預后分析的指標[11]。

對于HCCR的啟動子區(qū)使用生物信息學手段已經(jīng)找到多種轉錄因子的結合區(qū)，如ELK1等，故可以通過免疫組化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表達是否存在相關性，進一步的研究如細胞生物學干預，通過阻斷ERK通路是否影響HCCR的表達等，都能夠證實ERK通路在HCCR表達中的作用，而對于HCCR表達調(diào)控的詳細研究，有利于揭示該癌基因的真正特點。此次免疫組織化學檢測在胃癌組織中HCCR、pERK及pELK1表達較癌旁組織明顯增高，而且存在一定的相關性，提示HCCR的表達調(diào)控可能與ERK/ELK1通路有關，我們將進一步研究該通路調(diào)節(jié)HCCR表達的分子生物學機制。

[參考文獻]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艷，楊楊，張國新，等. HCCR蛋白表達載體的構建、表達及其蛋白純化[J]. 南京醫(yī)科大學學報，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）

HCCR過表達能夠抑制P53基因功能的表達，從而達到致腫瘤效應，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HCCR綁定蛋白3能夠負向調(diào)節(jié)p21及Bax，從而影響p53的功能[9]。在早期小細胞肝癌（直徑<2 cm）的診斷上，目前臨床上常規(guī)的檢查方法具有一定的局限性，往往造成檢出率較低，而腫瘤的治療關鍵在于早期診斷，早期治療，通過使用HCCR與AFP聯(lián)合檢測可以大幅度的提高早期小細胞肝癌的檢出率[10]。在食管癌的檢測中發(fā)現(xiàn)，HCCR在腫瘤組織中高表達，生存期的分析發(fā)現(xiàn)，HCCR高表達的食管癌患者預后較低表達的患者差，提示HCCR可作為食管癌患者預后分析的指標[11]。

對于HCCR的啟動子區(qū)使用生物信息學手段已經(jīng)找到多種轉錄因子的結合區(qū)，如ELK1等，故可以通過免疫組化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表達是否存在相關性，進一步的研究如細胞生物學干預，通過阻斷ERK通路是否影響HCCR的表達等，都能夠證實ERK通路在HCCR表達中的作用，而對于HCCR表達調(diào)控的詳細研究，有利于揭示該癌基因的真正特點。此次免疫組織化學檢測在胃癌組織中HCCR、pERK及pELK1表達較癌旁組織明顯增高，而且存在一定的相關性，提示HCCR的表達調(diào)控可能與ERK/ELK1通路有關，我們將進一步研究該通路調(diào)節(jié)HCCR表達的分子生物學機制。

[參考文獻]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艷，楊楊，張國新，等. HCCR蛋白表達載體的構建、表達及其蛋白純化[J]. 南京醫(yī)科大學學報，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）

HCCR過表達能夠抑制P53基因功能的表達，從而達到致腫瘤效應，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HCCR綁定蛋白3能夠負向調(diào)節(jié)p21及Bax，從而影響p53的功能[9]。在早期小細胞肝癌（直徑<2 cm）的診斷上，目前臨床上常規(guī)的檢查方法具有一定的局限性，往往造成檢出率較低，而腫瘤的治療關鍵在于早期診斷，早期治療，通過使用HCCR與AFP聯(lián)合檢測可以大幅度的提高早期小細胞肝癌的檢出率[10]。在食管癌的檢測中發(fā)現(xiàn)，HCCR在腫瘤組織中高表達，生存期的分析發(fā)現(xiàn)，HCCR高表達的食管癌患者預后較低表達的患者差，提示HCCR可作為食管癌患者預后分析的指標[11]。

對于HCCR的啟動子區(qū)使用生物信息學手段已經(jīng)找到多種轉錄因子的結合區(qū)，如ELK1等，故可以通過免疫組化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表達是否存在相關性，進一步的研究如細胞生物學干預，通過阻斷ERK通路是否影響HCCR的表達等，都能夠證實ERK通路在HCCR表達中的作用，而對于HCCR表達調(diào)控的詳細研究，有利于揭示該癌基因的真正特點。此次免疫組織化學檢測在胃癌組織中HCCR、pERK及pELK1表達較癌旁組織明顯增高，而且存在一定的相關性，提示HCCR的表達調(diào)控可能與ERK/ELK1通路有關，我們將進一步研究該通路調(diào)節(jié)HCCR表達的分子生物學機制。

[參考文獻]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艷，楊楊，張國新，等. HCCR蛋白表達載體的構建、表達及其蛋白純化[J]. 南京醫(yī)科大學學報，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）