水體中鹽酸環丙沙星的風險等級分析

董玉瑛，趙穎慧，鄒學軍，崔玉波，George Zhang

(1.大連民族學院環境與資源學院，遼寧大連116605;2.美國康寧公司生命科學部藥物相互作用研究中心)

鹽酸環丙沙星是第三代喹諾酮類藥物，其分子式為 C17H18FN3O3·HCl·H2O，分子量為385.82，是氟喹諾酮類藥物中抗菌活性強的品種，可直接作用于細菌的細胞核，抑制細菌的DNA旋轉酶，導致細菌快速死亡，因而被廣泛應用于漁業生產中以防治水生動物的各種傳染性疾病［1］。研究表明，鹽酸環丙沙星具有較嚴重的肝腎毒性，攝入量較多時會造成人體內臟損傷、消化系統出血、肝腎功能異常炎癥及衰竭、血液系統白血球減少等癥，神經系統的疾病和過敏癥也有發生［2-3］。這些施于水體的藥物不僅作用于靶生物以防治病害，而且對非靶生物也產生影響和毒害，從而導致水體微生態失衡以及生態系統結構、功能的破壞［4］。目前，關于鹽酸環丙沙星對不同食物鏈水生生物的急性毒性以及對水生生態環境的潛在風險尚未有明確清晰的分析。

發光菌、小球藻、大型蚤和孔雀魚分別是自然水體中單細胞生物、浮游植物、浮游動物和魚類四個營養級上的代表生物，也是目前水生生物毒理學研究的標準測試生物。本研究通過分析鹽酸環丙沙星對發光菌、小球藻、大型蚤和孔雀魚的急性毒性，獲得對不同食物鏈生物影響的預測無效應濃度，結合大連開發區的人口消費、醫藥生產企業、污水處理工藝等情況，評價鹽酸環丙沙星在大連灣水域中的風險等級。

1 材料與方法

1.1 水源

大連開發區污水處理廠排水口出水;大連灣養殖區水域。

1.2 儀器及試劑

儀器:DXY-2型生物毒性測試儀(中國科學院南京土壤研究所);85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);THZ-82氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠);DHP-9082電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-40CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠);BS214D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);不同量程的精密移液器(Thermo公司，美國);SJH型潔凈工作臺(沈陽市凈化儀器廠二分廠)等。

主要試劑:鹽酸環丙沙星片(哈藥集團制藥總廠);明亮發光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉(中國科學院南京土壤研究所微生物室)。發光菌凍干粉劑的復蘇、斜面菌種的培養、搖瓶菌液的培養、工作菌液的制備等過程見文獻［5］。

1.3 發光菌毒性實驗方法

根據預試驗的結果，將鹽酸環丙沙星溶液用3%NaCl溶液稀釋配制成10～15個濃度梯度，各取4.5 mL加入具塞磨口比色管，以4.5 mL 3%NaCl溶液作空白對照，每個濃度梯度設3組平行對照。將培養好的工作菌液取0.5 mL于各比色管中(控制空白對照管發光強度300～900 mV范圍內)，加塞充分振蕩，去塞，暴露15 min，用生物毒性測試儀測定暴露于不同濃度梯度鹽酸環丙沙星溶液中發光菌的發光強度。

對其他食物鏈生物的毒性數據源自文獻［4，6］。

1.4 預測無效應濃度(PNEC)的估算方法

應用基于生物毒性實驗的PNEC經驗估算方法［7-8］，表達式如下:

式中，評價因子分別為1 000(對單純營養級進行單次急性實驗);100(對不同的營養級進行3次急性實驗);10(進行慢性實驗)［9］。

1.5 預測環境濃度(PEC)的估算方法

藥物評價與遷移評估模型(Pharmaceutical Assessment and Transport Evaluation，簡稱 PhATETM)基于質量守恒方法建模進行水環境中APIs的濃度估算［10］。若不考慮大連經濟技術開發區污水處理廠的排水經過其他河流的遷移稀釋情況，則默認為直接排入海中。估算PEC簡易PhATETM模型描述如下:

式中，A(kg·a-1)為鹽酸環丙沙星年均排放量，R(%)為污水處理廠的去除率，P(人)為污水處理廠的服務人口，V(m3·d-1)為日人均廢水排放量，D為稀釋因子(無量綱)，PEC 單位為 g·L-1［9］。

1.6 環境風險等級甄別方法

對于環境生態評價標準，通過環境暴露濃度與效應濃度的比值，可以確定化學物質對生態環境的風險商(Risk Quotient，RQ)。商值法數學表達式為RQ=PEC/PNEC［11］。當風險商值 RQ為0.1～1.0時，表明需對生態環境進行觀察;當RQ在1.0以上時需采取相應的風險削減措施。

2 結果與討論

2.1 對發光菌發光強度的抑制作用

測定鹽酸環丙沙星對發光菌的毒性效應，其測試曲線如圖1。

圖1 鹽酸環丙沙星對發光細菌的毒性影響

從圖1中可以觀察到，鹽酸環丙沙星對發光菌發光強度的抑制曲線整體呈現單調非線性遞增趨勢，當質量濃度達到40 mg·L-1時，鹽酸環丙沙星對發光菌發光強度的相對抑制率大于20%;當質量濃度達到75 mg·L-1時，其相對抑制率接近80%。因此，鹽酸環丙沙星對發光菌發光強度影響的突躍范圍為40～75 mg·L-1。通過效應濃度相關分析得知，其EC50值為63.27 mg·L-1。

2.2 對不同食物鏈水生生物的急性毒性分析

鹽酸環丙沙星對小球藻、發光菌、大型蚤和孔雀魚的毒性數據匯總見表1。由表1可知，其急性毒性 EC50或者 LC50數值分別為 20.61，63.27，135.15，365.00 mg·L-1。毒性作用規律結果顯示，隨著生物鏈等級的升高，生物對環丙沙星的耐受程度升高。

表1 鹽酸環丙沙星對水生生物的急性毒性作用

2.3 PNEC的估算

結合 Cunningham V.L.［7］和 Marie P.H.［8］課題組的研究成果，基于生物毒性實驗的PNEC簡易估算方法，若對每種生物進行單一急性實驗時，則評價因子取1 000。結合急性毒性測定結果，由方程(1)計算不同水生物的PNEC值，所得結果見表1。

2.4 PEC的估算

簡易的PhATETM模型可對河流中鹽酸環丙沙星進行環境風險評價，能夠較好地預測醫藥品暴露的PEC值。應用該模型需要獲得化合物的特性參數和地域參數，包括藥品的年銷售量和藥品在不同過程的去除率等信息。由于鹽酸環丙沙星被大量應用于漁業養殖中，其在魚體內的代謝速度較慢，富集后殘留在魚體有一個較長的過程(對生物體的危害是通過藥物在魚體的殘留)，又經過食物鏈進入人體，因此，考慮鹽酸環丙沙星是作為獸藥大量進入水體，本研究中應用方程(2)分別計算污水處理后入海口以及近海岸養殖區海水水質中鹽酸環丙沙星的風險。

截至2012年底，大連經濟技術開發區戶籍人口統計約35萬人，流動人口近5萬人，即區域服務人口總數為40萬，家畜年養殖量視為定值。開發區污水處理一廠和開發區排水公司污水處理二廠共同承擔著全區污水處理工作。處理一廠日處理污水量為10萬m3;處理二廠日處理污水量為8萬m3，污水處理后排海(即日處理污水總量為18萬m3·d-1)。大連經濟技術開發區污水處理廠的出水未經過河流的遷移稀釋而直接排入海中，不考慮河流遷移的稀釋作用，故簡易PhATETM模型中的稀釋因子取1。區內沒有生產鹽酸環丙沙星片的制藥廠，因此，不考慮藥物制備車間的處理廢水這一項。根據對全區的分析，未經污水處理廠而直接排放的廢水和對未使用的藥品進行不合理處置進入環境的藥品量遠遠小于病人的直接排放量，因而不納入本研究的模型因子中。根據Golet等［12-13］的研究，污水處理廠普遍采用微生物厭氧和耗氧處理技術對常見醫藥品的均處理效率R為83%。在漁業養殖過程中，以大連灣海域大連灣口以北海區養殖面積與養殖深度的乘積為總體積(養殖面積約13.3×106m2，養殖深度大約在20 m之內)。將上述有關數據代入方程(2)中，計算獲得的PEC結果見表2。

表2 簡易PhATETM模型估算鹽酸環丙沙星的PEC

2.5 環境風險分析

根據風險評價的原理，風險是毒性效應和暴露水平的函數，即暴露在環境中的有毒物質達到一定水平時才能產生風險。在這里，毒性效應PNEC是可能對生物和生態系統造成潛在影響的估測濃度，表征物質產生風險的可能性;暴露濃度PEC是綜合了化合物分子的物理、化學、生物特性以及污水和地表水流量的水文信息而得到的濃度數據，表征物質產生風險的現實性［14］。基于藥品風險管理的設計思路，計算鹽酸環丙沙星的綜合評價因子PEC/PNEC的比值，結果見表3。

表3 鹽酸環丙沙星的環境風險綜合評價

根據計算出的綜合評價因子的范圍值，對大連開發區污水處理廠排水的檢測可以看出，評價因子的數值以小球藻最高，已達到6.102～7.291，小球藻可以作為評價水體中鹽酸環丙沙星殘留風險等級的生物標志物。

3 結論

(1)本實驗通過發光菌的毒性實驗，得到其EC50值為 63.27 mg·L-1，與文獻［4，6］所得小球藻、大型蚤、孔雀魚的EC50或者LC50數值進行比較分析，發現隨著生物等級升高，不同食物鏈受試生物毒性數值升高，即表明對外來污染物的耐受程度升高。

(2)將綜合評價因子(PEC/PNEC)作為環境風險表征參數，應用PEC和PNEC的估算模型，采用不同食物鏈水生生物對大連開發區污水處理廠排水及大連灣沿海養殖區中鹽酸環丙沙星的含量進行環境風險分析，發現小球藻的風險商數值達到6.102～7.291，可作為評價水體中鹽酸環丙沙星殘留風險等級的生物標志物。

［1］BURKE M D，CUNHA A.Antibiotic side effects［J］.Medical Clinics of North America，2001，85(1):149-185.

［2］鄺志堅.環丙沙星的不良反應研究［J］.廣東微量元素科學，2001，8(2):15-20.

［3］王翔，聶湘平，李凱彬.三氯異氰尿酸和環丙沙星對水生生物的急性毒性［J］.生態科學，2006，25(2):155-157，161.

［4］夏天驕，夏訓峰，徐東耀，等.基于固相萃取-高效液相色譜法的畜禽糞便中四環素類抗生素殘留量檢測［J］.安全與環境學報，2013，13(2):121-125.

［5］董玉瑛，雷炳莉，馬靜，等.助溶劑對發光菌生物毒性測試的影響［J］.化工學報，2006，57(3):635-639.

［6］房英春，齊躍，李瑩，等.鹽酸環丙沙星、恩諾沙星和諾氟沙星對孔雀魚急性毒性試驗研究［J］.沈陽大學學報，2012，24(3):15-17.

［7］ CUNNINGHAM V L，CONSTABLE D J，HANNAH R E.Environmental risk assessment of paroxetine［J］.Environ Sci＆ Technol，2004，38(12):3351-3359.

［8］MARIE P H，RORTAIS A，ARNOLD G，et al.New risk assessment approach for systemic insecticides:the case of honey bees and imidacloprid［J］.Environ Sci＆Technol，2006，40(7):2448-2454.

［9］董玉瑛，鄒學軍，陳崢，等.三種藥品聯合毒性作用及其環境風險分析［J］.環境化學，2013，32(7):1257-1262.

［10］PAUL D A，VINCENT J D，PETER S，et al.Screening analysis of human pharmaceutical compounds in U.S.surface waters［J］.Environ Sci＆ Technol，2004，38(3):838-849.

［11］雷炳莉，黃圣彪，王子健.生態風險評價理論和方法［J］.化學進展，2009，21(2/3)，350-358.

［12］GOLET E M，ALDER A C，GIGER W.Environmental exposure and risk assessment of fluoroquinolone antibacterial agents in wastewater and river water of the Glatt Valley Watershed，Switzerland ［J］.Environ Sci ＆Technol，2002，36(17):3645-3651.

［13］TAUXE W A，ALENCASTRO D L F，GRANDJEAN D，et al.Occurrence of several acidic drugs in sewage treatment plants in Switzerland and risk assessment［J］.Water Research，2005，39(9):1761-1772.

［14］董玉瑛，張陽，曹瑛.綜合評價法篩析水體中高風險醫藥品［J］.西南民族大學學報:自然科學版，2008，34(1):115-119.