泡菜中乳酸菌的分離及其苯乳酸產量研究

劉長建，劉 秋，姜 波，閆建芳，齊小輝

(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116605)

苯乳酸(PLA)又稱3-苯基乳酸，或β-苯基乳酸即2-羥基-3-苯基丙酸。苯乳酸是繼乳酸菌產生的第一代抑菌物質如乳酸、醋酸和第二代抑菌物質如乳鏈菌素、片球菌素等細菌素以外的第三代天然抑菌物質。能抑制有害微生物的生長和發育，抑制有害微生物產生毒素，有效抵抗細菌和病毒的感染，進而提高機體的免疫力，保持機體健康狀態［1］。Dieuleveux發現，苯乳酸抑菌譜廣，對G+細菌、G-細菌和真核微生物均有抑制作用，這與Nisin等細菌素顯著不同。大部分細菌素只對與產生菌分類學上相近的細菌有作用，如Nisin抑制許多除乳酸菌以外的G+細菌，但對絕大部分G-細菌和酵母菌、霉菌沒有作用［2］。乳酸菌的某些屬種具有合成苯乳酸的能力，國外專利及文獻中已報道從不同生物來源特別是發酵食品中分離得到合成苯乳酸的乳酸菌菌株，如Lactobacillus plantalum 等［1，3-4］。

本實驗嘗試從發酵食品泡菜中分離出能產生苯乳酸的乳酸菌株，使其在食品、醫藥、化工等領域發揮新的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

發酵食品泡菜購自大連市場。

1.2 儀器及試劑

主要儀器包括液相色譜儀(日本島津);UV-2450分光光度計(日本島津);DNP-9052恒溫培養箱(上海精宏);TC-512基因擴增儀(Techne)等。PCR反應所用的相關試劑均購于大連寶生物。其他試劑均為天津科密歐分析純產品。

1.3 培養基

分離用培養基:MRS培養基(Merck)和M17培養基(Oxoid)。

其他培養基:PY培養基、PYG培養基和含6.5%，18%NaCl的 MRS 培養基［5］;含苯丙氨酸(PPA)的液體培養基。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的初步分離及純化

取1.0 g樣品加入9.0 mL無菌水室溫浸泡24 h。連續稀釋后取100 μL分別涂布于含碳酸鈣的2種分離固體培養基，37℃靜置培養24～48 h。挑取產生溶鈣圈的單菌落，轉接于對應的分離培養基中，37℃培養24 h，純化2次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、HPLC法檢測產乳酸［6］的菌株進行下一步研究。

1.4.2 菌落形態、菌體細胞形態及生理生化特性

乳酸菌接種平板后，37℃恒溫培養，48 h后記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色、與培養基的結合程度等菌落特征。同時高倍顯微觀察菌體革蘭氏染色、個體形狀、大小等細胞特征。分別測定菌株在10℃和45℃的生長情況、運動性、耐鹽性等生理生化特征［5］。

1.4.3 菌株的分子生物學鑒定

將純化得到的菌種在37℃條件培養2 d后，離心收集菌體，提取細菌總DNA。采用通用引物對其16S rDNA進行擴增，并進行測序后將序列輸入NCBI核酸數據庫中，與基因庫內所有核酸序列進行系統發育分析［6］。

1.4.4 乳酸菌產苯乳酸試驗

將菌株以2%的接種量分別接種于含0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%苯丙氨酸的MRS液體培養基，37℃靜置培養48 h。將菌株按2%的接種量接入含最適濃度苯丙氨酸的MRS液體培養基，于37 ℃培養箱中分別靜置培養 24，36，48，60，72 h。發酵液離心后取上清，0.2 μm的膜過濾，高效液相色譜測定苯乳酸的含量［1，6］。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選分離

根據菌落形態共篩選出12株疑似乳酸菌，轉接于對應的分離培養基中，純化2次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、發酵產乳酸［6］的、生長較好的2個菌株。

2.2 菌株的多相鑒定

2.2.1 菌落特征、細胞形態

2個菌株在MRS培養基上培養36 h后菌落均為乳白色，邊緣光滑、圓整、粘稠，直徑在0.3～0.5 mm。革蘭氏染色呈陽性，細胞短桿狀，細胞間呈短鏈或球狀排列(如圖1)。

圖1 菌株細胞形態的顯微觀察(×100)

2.2.2 耐鹽、耐溫特征

乳酸菌LMD在10℃和45℃均不生長，而LRA2在10℃不能生長，但能耐受 45℃;在6.5%NaCl時2個菌株都能生長，而菌株LRA2在NaCl質量體積達到18%時不能生長(見表1)。

表1 菌株生長特性

2.2.3 16S rDNA序列分析

以菌株LMD、LRA2總的DNA為模板，擴增獲得了2條特異的擴增條帶，長度分別為1387 bp和1090 bp。將序列提交到GenBank獲得登錄號分別為KC108666和KC108667。通過Blast程序與GenBank核酸序列庫中的序列進行比對，發現LMD和LRA2與多株腸膜明串珠菌的相似性都超過99%。明串珠菌屬共13個種［7］的eztaxon網站的16S rRNA序列，與菌株LMD和LRA2進行聚類分析(如圖2)，菌株 LMD和 LRA2與 Leuconostoc mesenteroides的3個亞種在同一分支上。因此可以確定菌株LMD和LRA2屬于明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。圖2中分支上的數值為自舉1 000次的結果，當數值≥51%時顯示。

圖2 菌株LMD、LRA2和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統發育樹

2.3 乳酸菌產苯乳酸能力

乳酸菌LMD和LRA2皆能產苯乳酸，且產量隨著培養基中PPA質量濃度上升而變大(如圖3)。當培養基中PPA達到0.16%時，菌株的苯乳酸產量增加趨勢變緩;當到達0.2%時，菌株LMD苯乳酸產量達0.132 2 mg·mL-1，菌株LRA2 產量達 0.124 5 mg·mL-1。

圖3 培養基中苯丙氨酸含量對菌株產苯乳酸量的影響

當培養基中含0.16%PPA時，菌株的苯乳酸產量隨時間增加而增加(如圖4)。前48 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產量增加緩慢;而在48～60 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產量增加趨勢最快。當培養72 h時，菌株產苯乳酸含量最高，LMD和LRA2的苯乳酸產量分別達0.144 7 mg·mL-1和 0.158 5 mg·mL-1。

圖4 培養時間對菌株產苯乳酸量的影響

3 結論與討論

乳酸菌在自然界分布廣泛，實驗從泡菜中初步分離得到過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、發酵液產乳酸的乳酸菌12株，通過溫度、高鹽試驗篩選到2株乳酸菌LMD和LRA2。根據菌落、細胞形態、生理生化特性以及16S rDNA序列比對，可鑒定LMD和LRA2為腸膜明串珠菌。采取在培養基中添加苯丙氨酸的方法，利用HPLC法測定乳酸菌發酵液中苯乳酸的產量，菌株LMD和LRA2均能利用苯丙氨酸產苯乳酸。苯乳酸的產量與培養基中苯丙氨酸的添加量呈正相關;當苯丙氨酸的添加量為0.16%時，苯乳酸的產量與培養時間呈正比，在48～60 h產量增加最快;在72 h時，LMD的苯乳酸產量為0.144 7 mg·mL-1，LRA2的苯乳酸產量為0.158 5 mg·mL-1。

已經有 Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Leuconostoc等多個屬的細菌能產苯乳酸的報道［1，3，4，8，9］，如李興峰［1］等分離的 112 株乳酸菌中有70株的苯乳酸產量在0.0166～0.0914 mg·mL-1。但目前明串珠菌屬的報道不多，只有Valerio［8］等從橄欖葉中分離的Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ITMY30能產生0.094 6 mg·mL-1苯乳酸，低于本研究分離的Leuconostoc mesenteroides LMD和LRA2的苯乳酸產量。本研究和其他研究表明，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代謝產物，個體差異大，其產量取決于菌株個體［1，8］。目前看來短期內苯乳酸不能完全取代化學防腐劑和抗生素，但從長遠觀點看，隨著科學技術的發展，本實驗篩選出的高產苯乳酸菌株可作為菌株資源進行深入的研究。

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