力竭運動后小鼠前腦皮層和海馬神經元功能的變化及其機制

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(1. 山東省體育科學研究中心， 山東 濟南 250102；2.曲阜師范大學 生命科學學院， 山東 曲阜 273165)

力竭運動后小鼠前腦皮層和海馬神經元功能的變化及其機制

蔡成法1，李亞2

(1. 山東省體育科學研究中心， 山東 濟南 250102；2.曲阜師范大學 生命科學學院， 山東 曲阜 273165)

目的：研究力竭游泳運動對小鼠前腦皮層和海馬神經元功能的影響及其作用機制。方法：采用力竭游泳運動小鼠模型，檢測反復(4周)力竭游泳運動后即刻(0小時)、12小時、24小時和1周小鼠前腦皮層、海馬突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度的變化，通過Morris水迷宮測試小鼠空間學習記憶能力。結果：反復力竭游泳運動后，與正常對照組小鼠比較，力竭運動組在12 h和24 h小鼠的逃避潛伏期(訓練周期1)明顯增加，第一象限停留時間明顯減少，其空間學習記憶能力顯著降低(Plt;0.01，Plt;0.05)；力竭運動組小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜流動性在0 h、12 h顯著降低(Plt;0.01，Plt;0.05) ；前腦皮層和海馬突觸體內游離Ca2+濃度在0 h、12 h和24 h顯著增加 (Plt;0.05，Plt;0.01)，力竭運動后1周前腦皮層和海馬突觸體內游離Ca2+濃度明顯恢復(Plt;0.05)。結論：力竭游泳運動所致小鼠空間學習記憶功能損傷以及運動性中樞疲勞的產生和恢復可能與突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度的變化密切相關。

力竭運動；膜流動性；Ca2+濃度；空間學習記憶；海馬；前腦皮層

力竭性運動表現為動物或人進行運動直到完全不能運動為止[1]。由于運動負荷過大，超過機體的承受能力，可引起機體多器官功能紊亂，尤其是導致中樞神經系統運動性疲勞，造成腦功能損傷。前腦皮層和海馬是腦內運動的調控、學習記憶、神經內分泌及認知功能的重要區域，也是最易受運動應激損傷的腦區[2]。突觸體膜的結構和功能變化可引起突觸處信息傳遞效能發生改變，尤其是突觸體膜流動性的改變將影響膜的離子通透性、跨膜物質轉運、胞內信號轉導等。在腦內神經元受損及腦的老化過程中，膜流動性也顯示相應的改變[3]。本研究建立4周反復力竭游泳運動小鼠模型，測定力竭游泳運動和恢復期小鼠Morris 水迷宮空間學習記憶能力，檢測小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜流動性、突觸體內游離Ca2+濃度的變化，探討力竭游泳運動對小鼠空間學習記憶功能影響，以及運動性中樞疲勞產生與恢復的突觸機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

3月齡健康昆明品系小白鼠，雌雄各半，山東魯抗醫藥股份有限公司動物實驗中心提供。適應性喂養一周后隨機分為：正常對照組，反復性力竭游泳運動組。

1.2 力竭游泳運動小鼠模型的建立

建立4周反復力竭游泳運動小鼠模型。實驗用小鼠接受連續3d的適應性游泳訓練，自由游泳每天一次，持續時間分別為15 min、30 min、45 min逐日遞增。水溫30±2 ℃。4周反復力竭游泳運動小鼠，每天游泳訓練一次，每次游泳訓練均至力竭，每周5天；為避免力竭訓練組大鼠在訓練過程中產生適應現象，在訓練的后期采用負重(體重的2%)的方法增加游泳訓練的強度，每次訓練均要求達到力竭狀態。力竭游泳運動標準為：1)游泳動作明顯失調，不能再堅持；2)沉入水底超過3 s不能回到水面。停止游泳運動訓練，及時撈起，吹干毛發，放回飼養籠中休息。力竭游泳運動后即刻(0小時)、12小時、24小時和1周，檢測小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度。

1.3 Morris水迷宮學習記憶能力檢測

力竭游泳運動后12小時、24小時和1周，對小鼠實施Morris水迷宮實驗。Morris 水迷宮包含定位航行實驗(Place navigation test)和空間搜索實驗(Spatial probe test)。定位航行實驗歷時2 d，每只小鼠每天接受8次找平臺訓練，分2個訓練周期(上午和下午)，每個訓練周期4次，每次訓練2 min。記錄小鼠尋找到隱藏在水下平臺時間即逃避潛伏期，檢測小鼠在水迷宮中的學習能力；第3 d撤除平臺進行空間搜索實驗，從第三象限將小鼠放入水中，記錄120 s內小鼠在4個象限游泳(停留)時間，檢測小鼠對原平臺(目標象限)記憶保持能力。

1.4 突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度的測定

將各組小鼠斷頭處死，在冰臺上迅速分離兩側前腦皮層和海馬并稱重，加入10倍體積的0.32 M蔗糖溶液(內含10 mM Hepes，pH 7.4，W:V = 1:10)進行勻漿。按差速蔗糖梯度離心法分離制備突觸體，最后用人工腦脊液(ACSF)緩慢懸浮，得到突觸體懸液，所有操作均在0～4 ℃進行。分別取前腦皮層和海馬突觸體懸液，用ACSF調整蛋白濃度為0.3 mg/ml，與等體積的熒光探針DPH(Fluka公司產品，終濃度2×10-6M)稀釋液，置于37 ℃恒溫孵育30 min。用熒光偏振法檢測突觸體膜的熒光偏振度(P)，測定溫度37 ℃。用膜各向異性(anisotropy)r值表示突觸體膜的流動性大小，r值越小，膜流動性越大。取前腦皮層和海馬突觸體懸液，用ACSF調整蛋白濃度為1.5～2.5 mg/ml，加入Fura 2-AM(Sigma公司產品，終濃度：5 μ M), 37 ℃恒溫孵育30 min后，于11 000 ×g離心10 min，取沉淀，用ACSF懸浮，于0～4 ℃下保存直至熒光測定。采用雙波長測定，選擇Fura-2與Ca2+結合和游離的激發波長340 nm和380 nm，發射波長為509 nm。在37 ℃條件下，測定其熒光強度及熒光比值。計算突觸體內鈣離子濃度。

1.5 統計學分析

所有數據以均數±標準差(± s)表示，采用SPSS 13.0進行統計學分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，對各象限游泳時間及力竭運動后各時間點數據進行多重比較，逃避潛伏期采用重復測量方差分析，行LSD-t檢驗或非配對t檢驗。Plt;0.05表示具有統計學顯著性差異。

2 結果

2.1 小鼠定位航行學習能力的變化

統計分析結果表明(表1)，正常對照組與力竭運動后各組小鼠逃避潛伏期均顯著減少(Pgt;0.05，Plt;0.01)。與正常對照組比較，力竭運動后12 h、24 h在2天的四個訓練周期，都有顯著性差異(Plt;0.01)。而力竭運動后1周，小鼠在第三和第四訓練周期時逃避潛伏期顯著增多(Plt;0.05)。結果說明小鼠反復力竭運動后12 h、24 h空間學習能力下降，力竭運動后1周小鼠的空間學習能力有所恢復。

表1 各組小鼠的逃避潛伏期(秒，

2.2 小鼠空間搜索記憶能力的變化

結果顯示，各組小鼠均在第一象限的停留時間最長(表2)。正常對照組力竭運動后1周小鼠在第一象限的停留時間較其它三個象限的停留時間明顯增多(Plt;0.05，Plt;0.01)；與正常對照組比較，力竭運動后12h和24h小鼠在第一象限的停留時間明顯減少(Plt;0.05，Plt;0.01)，結果表明，力竭運動后12h、24h小鼠的空間記憶保持能力明顯減弱。

表2 小鼠慢性應激后在四個象限的游泳時間(秒，

2.3 小鼠突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度的變化

力竭運動后，力竭運動組小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜的r值顯著增加(表 3)，表明力竭游泳運動引起突觸體膜流動性顯著降低。與正常對照組比較，力竭運動后即刻(0小時)、12小時，小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜流動性明顯降低(Plt;0.05，Plt;0.01)。力竭運動后24小時、1周小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜的r值逐漸減小；與力竭運動后即刻比較，在力竭游泳后1周小鼠海馬突觸體膜流動性明顯增加(Plt;0.05)。與正常對照組相比，力竭運動后即刻、12小時，小鼠前腦皮層和海馬突觸體內游離Ca2+濃度顯著升高(Plt;0.05，Plt;0.01)。力竭運動后24小時、1周小鼠前腦皮層和海馬突觸體內游離Ca2+濃度逐漸降低；與力竭運動后即刻比較，力竭運動后1周小鼠前腦皮層和海馬突觸體內游離Ca2+濃度有統計學顯著差異(Plt;0.05)。

表3 小鼠突觸體膜流動性和游離Ca2+濃度

3 討論

已有研究報道，過度運動后可引起大鼠大腦皮質的超微結構發生明顯改變，而力竭運動后的一定時間內，大腦皮質結構得損傷可持續存在，可以推測腦組織結構出現異常變化，引起大腦的調節功能減退，導致運動性中樞疲勞的產生[4]。研究表明，6周的力竭游泳訓練可引起動物海馬神經元損傷，而腦源性神經營養因子(BDNF)可能參與了力竭運動后腦損傷的保護和修復過程[5]。

大量運動實踐表明，長期大運動量訓練誘導機體運動機能下降或運動性疲勞發生時，機體應激反應增強，血液中皮質醇維持在高水平，而海馬對于介導應激反應，具有重要的調節作用[6]。研究表明，慢性應激對海馬介導的記憶有持久性損傷作用，這可能是通過改變海馬突觸可塑性而影響腦海馬區的功能活動[7]。在中樞神經系統，應激因素除對海馬有影響外，對其它腦區，如前額葉、杏仁核等也有作用[8]。已經明確，適宜的膜流動性是維持生物膜正常功能的必須條件。腦內海馬神經細胞內Ca2+平衡失調，亦可導致海馬神經細胞受損，引起動物空間學習記憶功能減退[9]。我們先前的研究表明，慢性應激后，小鼠前腦皮層和海馬突觸體膜流動性顯著降低，而突觸體內游離Ca2+濃度的顯著增加[10]，導致小鼠前腦皮層和海馬功能受損。因此，可以推測，在本研究中反復力竭游泳運動后，突觸體內游離Ca2+濃度顯著增加，而突觸體膜流動性明顯降低，引起神經元突觸傳遞效能降低，導致前腦皮層和海馬神經元功能受損，空間學習記憶受損。力竭運動引起的這些變化可能與小鼠運動性中樞疲勞產生和恢復高度相關。

4 結論

4.1 力竭運動可損傷小鼠前腦皮層和海馬神經元功能，繼而降低其空間學習記憶功能。

4.2 突觸體膜流動性和突觸體內游離Ca2+濃度的變化可能是力竭運動所導致小鼠運動性中樞疲勞產生和恢復的重要機制之一。

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Effects of exhausted exercise on the prefrontal cortex and hippocampus function in mice and its mechanism

CAI Cheng-fa1,LI Ya2

(1. Shandong Research Center of Sports Sciences, Jinan 250102, Shandong, China. 2.College of Life Sciences, Qufu Normal University, Qufu 273165, Shandong, China)

Objective:To study the effect of exhausted exercise on the prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HP) function and its mechanism.Methods:The repeatedly (4 weeks) exhausted exercise model mice were applied. The spatial learning-memory abilities of mice were tested, using Morris water maze task. The changes of synaptosomal membrane fluidity and [Ca2+] i of the PFC and HP in exhausted exercise mice brain were examined, at 0 h (immediately),12 h,24 h, respectively.Results:After repeatedly exhausted exercise, the escape latency was significantly increased and the swimming time of first quadrants were significantly decreased at 12 h, 24 h in exhaustive exercise group mice(Plt;0.01,Plt;0.05). Compared with control mice, the ability of spatial learning and memory of the exhaustive exercise group mice were significantly reduced. The membrane fluidity of synaptosomes in PFC and HP of exhaustive exercise group mice were significantly decreased at 0 h and 12 h (Plt;0.05,Plt;0.01), compared with control group mice. The synaptosomal[Ca2+]i in PFC and HP were significantly increased at 0 h, 12 h and 24 h(Plt;0.05,Plt;0.01) in exhaustive exercise group mice. The [Ca2+]i in PFC and HP at 1 week were significant reduced than the exhaustive exercise 0 h group mice(Plt;0.05), respectively.Conclusion:The generation and recovery of exercise-induced central fatigue and the damage of spatial learning and memory function in mice after exhausted exercise which may be nearly related to the changes of membrane fluidity and [Ca2+]i of synaptosomes.

exhausted exercise; membrane fluidity; free calcium concentrations; spatial learning-memory; hippocampus; prefrontal cortex

2014-05-06

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金項目(編號：BS2012SW021)，山東省自然科學基金(編號：ZR2009DL009)。

蔡成法(1974- )，男，博士，助理研究員，研究方向運動生理生化。

A

1009-9840(2014)05-0080-03