乙型肝炎表面抗原和表面抗體同時(shí)陽性患者隨訪分析＊

劉 勇，周錦勇，潘金順，李 雷，顧光煜△（1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院科研部，南京 10008 ；.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 10008 ；3.江蘇省醫(yī)學(xué)分子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 10008）

我國5歲以下的兒童乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性率已降至1%左右，但總體人群陽性率仍高達(dá)7.16%［1－2］。診斷乙型肝炎病毒（HBV）感染的常用指標(biāo)是外周血HBV血清學(xué)標(biāo)志物，包括HBsAg和乙型肝炎表面抗體（抗－HBs）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和e抗體（抗－HBe）以及乙型肝炎核心抗體（抗－HBc）。其中 HBsAg是診斷 HBV感染的主要標(biāo)志物，HBsAg陽性，通常可明確為HBV感染；而抗－HBs是HBsAg的中和抗體，其陽性表示對HBV有免疫力，常見于HBV既往感染或接種HBV疫苗者［3－4］。通常外周血 HBsAg和抗－HBs不同時(shí)存在，但同時(shí)陽性的特殊情況確實(shí)存在，目前臨床檢測HBV血清學(xué)指標(biāo)時(shí)，HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。國內(nèi)外研究顯示其發(fā)生率約為HBsAg陽性患者的2.5%～5%［5－7］。然而 HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性患者的血清學(xué)動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)卻少見報(bào)道，本研究對此類病例進(jìn)行隨訪，觀察其血清學(xué)標(biāo)志物變化情況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2008年1月至2010年4月13 080 例HBsAg陽性患者，其中HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性的患者476例（3.64%）。本研究對其中53例患者進(jìn)行了3.0～33.5個(gè)月的隨訪，其中男36例，女17例，隨訪前年齡18～92歲，平均（54±19）歲。將首次發(fā)現(xiàn)患者HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性的時(shí)間定為隨訪前，而對其隨訪的時(shí)間定為隨訪后，隨訪內(nèi)容包括血清HBV標(biāo)志物定量檢測，HBV DNA定量檢測及血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測。隨訪前HBeAg陽性率為39.6%（21／53），所有患者隨訪前后抗－HBc均為陽性。本研究中均排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎及艾滋病病毒感染患者。

1.2 儀器與試劑 美國雅培制藥有限公司雅培Architect i2000SR儀器及其配套試劑盒；美國MJ OPTICON2型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀；上海申友生物技術(shù)公司熒光定量PCR試劑盒；日本日立7600全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 分組設(shè)計(jì) 53例患者隨訪期間，4例（7.55%）HBsAg轉(zhuǎn)為陰性，13例（24.53%）抗－HBs轉(zhuǎn)為陰性，而36例（67.92%）HBsAg和抗－HBs仍同時(shí)為陽性。根據(jù)其 HBsAg和抗－HBs變化進(jìn)行分為3組，低于正常參考值，為HBsAg轉(zhuǎn)陰組；抗－HBs水平降至10mIU／mL，為抗－HBs水平轉(zhuǎn)陰組；血清HBsAg和抗－HBs仍為同時(shí)陽性，為持續(xù)組。

1.3.2 血清 HBV標(biāo)志物定量檢測 采用雅培Architect i2000SR儀器及其配套試劑盒進(jìn)行定量檢測。操作嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。依據(jù)試劑盒說明書設(shè)定正常值參考標(biāo) 準(zhǔn)：HBsAg≤0.05IU／mL，抗－HBs≤10mIU／mL，HBeAg≤1S／CO，抗－HBe≥1S／CO，抗－HBc≤1S／CO。對于HBsAg檢測結(jié)果大于250IU／mL的標(biāo)本用含15%小牛血清的磷酸鹽緩沖液稀釋100～200倍后再重新檢測。

1.3.3 血清HBV DNA定量檢測用熒光定量PCR試劑盒檢測HBV DNA載量。具體方法為采用煮沸法從40μL血清中提取DNA，然后取4μL DNA加入21μL試劑盒混合反應(yīng)液內(nèi)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?2℃5min，94℃5 min，94℃5s及60℃40s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后37℃保溫，在PCR循環(huán)第2步60℃時(shí)收集熒光信號，試驗(yàn)中設(shè)臨界對照、陽性對照及陰性對照。試劑盒最低檢出值為500IU／mL，檢測結(jié)果大于500IU／mL時(shí)，按實(shí)際檢測結(jié)果報(bào)告，小于500IU／mL時(shí)均報(bào)告“＜500IU／mL”。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)，對小于500IU／mL數(shù)據(jù)均用200IU／mL表示。

1.3.4 肝功能指標(biāo)檢測 采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測血清ALT，操作嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。ALT結(jié)果以大于40U／L時(shí)認(rèn)定為異常。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SSPS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以或中位數(shù)M（最小值～最大值）描述，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用 Mann－Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，隨訪前后數(shù)據(jù)用配對樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性患者HBV血清學(xué)標(biāo)志的變化 53例患者隨訪期間，4例（7.55%）HBsAg轉(zhuǎn)為陰性，13例（24.53%）抗－HBs轉(zhuǎn)為陰性，而36例（67.92%）HBsAg和抗－HBs仍同時(shí)為陽性。隨訪前各組 HBsAg、抗－HBs、HBV DNA水平等指標(biāo)進(jìn)行分析，見表1。HBsAg轉(zhuǎn)陰組中隨訪前有1例 HBsAg水平為131.48IU／mL，其余3例為0.06～0.11 IU／mL。該組 HBsAg、抗－HBs、HBV DNA水平都明顯低于抗－HBs轉(zhuǎn)陰組和持續(xù)組（P＜0.05）；而抗－HBs轉(zhuǎn)陰組的 HB－sAg及HBV DNA水平與持續(xù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但抗－HBs轉(zhuǎn)陰組的抗－HBs中位數(shù)水平為14.86mIU／mL（10.48～108.74mIU／mL），低于持續(xù)組的36.56mIU／mL（11.56～352.51mIU／mL）（P＜0.05）。

2.2 HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性患者隨訪前后HBV標(biāo)志物比較 隨訪前后HBsAg中位數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.905）；持續(xù)組隨訪前后抗－HBs水平中位數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.182）；隨訪后HBV DNA水平較隨訪前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.021）；隨訪前后血清ALT水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。隨訪后有4例患者HBeAg轉(zhuǎn)為陰性，但隨訪前后HBeAg陽性率變化沒有差異。

表1 不同隨訪結(jié)局患者HBV標(biāo)志物比較

表2 HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性患者隨訪前后HBV標(biāo)志物比較

3 討 論

血清中HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性是一種特殊HBV感染情況，研究顯示HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性與肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生密切相關(guān)［8－9］，而在最新的《慢性乙型肝炎防治指南》中并未提及對該類患者的診治及管理［10］，因此有必要加強(qiáng)對此類人群的HBV感染特征及臨床轉(zhuǎn)歸的研究。本研究對53例HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性的患者HBV血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行了隨訪分析，結(jié)果顯示67.92%的患者血清中抗－HBs可伴隨HBsAg長期存在，而24.53%患者血清抗－HBs為一過性升高，而7.55%的患者血清HBsAg轉(zhuǎn)為陰性。

抗－HBs為保護(hù)性抗體，陽性表示對 HBV有免疫力，是HBV感染恢復(fù)的標(biāo)志［2］。目前一些研究認(rèn)為在普通慢性HBV感染者體內(nèi)B細(xì)胞仍能持續(xù)分泌抗－HBs，但由于抗－HBs與HBsAg形成免疫復(fù)合物以致抗－HBs不能被常規(guī)檢測方法所檢出［11］。而當(dāng)機(jī)體被另一株病毒所重復(fù)感染或HBV發(fā)生變異時(shí)，原B細(xì)胞所分泌的抗－HBs不能與新產(chǎn)生的HBsAg有效結(jié)合，從而導(dǎo)致HBsAg和抗－HBs共存。先前研究表明HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性患者HBsAg水平明顯低于普通HBV感染者［6］，HBsAg持續(xù)存在的原因可能為抗－HBs僅能中和血液中的病毒或部分HBsAg，但不能清除肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，肝細(xì)胞不斷釋放病毒和HBsAg［12］。本研究表明部分患者體內(nèi)可長期存在HBsAg與抗－HBs，隨訪后患者血清HBsAg與抗－HBs水平、HBeAg陽性率及ALT與隨訪前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），盡管隨訪后HBV DNA水平較隨訪前有所降低，但其降低幅度在同一數(shù)量級內(nèi)，表明抗－HBs的出現(xiàn)并不是HBV清除的標(biāo)志，這是由于HBV清除的關(guān)鍵是肝細(xì)胞內(nèi)病毒的清除，其主要依賴于細(xì)胞免疫的參與［13］。

本研究中有4例患者血清HBsAg轉(zhuǎn)為陰性，其HBsAg清除率為7.55%，平均每年清除率為6.71%，高于慢性HBV攜帶者年 HBsAg自發(fā)清除率1.60%～2.38%［14－15］，該組患者HBsAg及HBV DNA水平明顯低于抗－HBs轉(zhuǎn)陰和持續(xù)組，其HBeAg也均為陰性，表明HBsAg及HBV DNA水平較低、HBeAg陰性患者更易發(fā)生HBsAg轉(zhuǎn)陰；4例患者中2例抗－HBs在HBsAg轉(zhuǎn)陰后增高達(dá)10倍以上，推測其抗－HBs可能對機(jī)體HBV的清除具有一定作用。隨訪中21例HBeAg陽性的患者僅有2例（9.52%）發(fā)生了抗－HBs轉(zhuǎn)陰，其余19例（90.48%）隨訪后血清學(xué)標(biāo)志物沒有發(fā)生改變；而28例HBeAg陰性的患者有13例（46.43%）發(fā)生了抗－HBs轉(zhuǎn)為陰性，這表明HBeAg陰性的HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性的患者更易發(fā)生抗－HBs改變。此外，抗－HBs轉(zhuǎn)陰患者隨訪前血清抗－HBs水平明顯低于HBsAg與抗－HBs持續(xù)存在患者，因此推測HBeAg陰性、血清抗－HBs水平較低的HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性患者更易發(fā)生抗－HBs轉(zhuǎn)陰。

盡管近年來有關(guān)HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性的報(bào)道較多，對產(chǎn)生HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性的機(jī)理有了初步了解，但其確切機(jī)理并不明確。產(chǎn)生HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性的原因可能是多方面的，如HBV患者處于血清轉(zhuǎn)化期，免疫壓力、藥物治療所導(dǎo)致的HBV DNA突變等［16］。研究者Pondé總結(jié)認(rèn)為HBV感染者體內(nèi)HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性的可能原因如下：（1）抗－HBs免疫壓力所產(chǎn)生的HBV選擇性逃逸突變；（2）患者被另一 HBV病毒株重復(fù)感染；（3）HBV再激活；（4）抗－HBs檢測假陽性［17］。目前普遍認(rèn)為病毒變異是產(chǎn)生HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性的主要原因，尤其是HBV Pre S氨基酸缺失突變，S基因主要親水區(qū)MHR變異及‘a(chǎn)’決定簇的變異，使體內(nèi)抗－HBs不能識(shí)別或結(jié)合 HBsAg，從而導(dǎo)致HBsAg和抗－HBs共存［5，18－20］。但也有研究經(jīng)過比較HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性患者與普通慢性HBV感染者的HBV變異，發(fā)現(xiàn)其HBsAg變異沒有差異，認(rèn)為HBsAg和抗－HBs同時(shí)陽性與HBsAg變異沒有相關(guān)性［21］。本研究中HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性患者中近70%患者的抗－HBs持續(xù)陽性，且隨訪前后患者血清HBsAg與抗－HBs水平、HBeAg陽性率與隨訪前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測其HBV S基因可能發(fā)生變異，導(dǎo)致抗－HBs不能完全中和HBsAg。

本研究表明超過半數(shù)HBsAg與抗－HBs同時(shí)陽性HBV感染者抗原與抗體可長期存在，血清HBsAg及HBV DNA水平較低、HBeAg陰性的患者更易發(fā)生HBsAg轉(zhuǎn)陰，應(yīng)對該類患者進(jìn)行隨訪，及時(shí)觀察其疾病變化情況。

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