胃癌患者血清抑癌基因啟動(dòng)子超甲基化測(cè)定的臨床意義

朱立岳，胡雷光，翁麗貞（上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院／復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院靜安分院檢驗(yàn)科 200040）

胃癌是臨床上較常見的惡性腫瘤之一，學(xué)者們一直致力于其發(fā)生、發(fā)展的研究。近些年來(lái)表觀遺傳學(xué)成為胃癌的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，其研究致力于基因序列未發(fā)生變化，而表達(dá)水平改變的情況。其中基因啟動(dòng)子超甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活，表達(dá)下降的重要原因，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，是表觀遺傳學(xué)重要的研究方向之一［1－2］。Ras相關(guān)區(qū)域家族基因1a（RASSFA1）基因、人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runx3）基因、錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutL同源物1（hmLH1）基因、多腫瘤抑制基因1（MTS1）也稱P16基因、上皮E鈣粘蛋白（E－Cadherin）基因、組織因子途徑抑制物2（TFPI－2）基因啟動(dòng)子超甲基化與胃癌的關(guān)系相繼被報(bào)道［3－11］，這些研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中這6種基因的甲基化檢出率較癌旁組織和正常組織高。說(shuō)明這些基因啟動(dòng)子超甲基化與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是胃癌的重要抑癌基因，有可能成為胃癌診斷的分子標(biāo)志物。以往研究在血清游離DNA中發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)的基因突變，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞釋放是血清游離DNA的主要來(lái)源之一［14］。如果能從胃癌患者血清中檢測(cè)到抑癌基因啟動(dòng)子的超甲基化，將是一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)新方法，對(duì)胃癌的診斷及治療具有重要意義。本文通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）方法測(cè)定血清游離 DNA中 RASSF1A、RUNX3、hm－LH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析血清中檢出基因超甲基化與胃癌的關(guān)系，探討其在胃癌診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選擇本院2011～2013年進(jìn)行胃鏡檢查的患者，32例為胃癌組，其中男18例，女14例，年齡37～75歲。29例作為萎縮性胃炎組，其中男13例，女16例，年齡34～74歲。隨機(jī)選取同期胃鏡檢查排除淺表性胃炎的其他胃部疾患者30例為對(duì)照組，其中男15例，女15例，年齡33～73歲。所有研究對(duì)象均經(jīng)病理診斷確診，且排除其他部位腫瘤，未進(jìn)行胃癌手術(shù)及放化療。3組患者在性別、年齡等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有標(biāo)本取材及測(cè)定數(shù)據(jù)的使用均經(jīng)研究對(duì)象同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 取所有研究對(duì)象血液4mL，自然凝固后以相對(duì)離心力（RCF）1 000 ×g離心5min后分離血清，轉(zhuǎn)移至凍存管中－70℃保存。

1.2.1 血清游離DNA抽提 使用微量樣品基因組DNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，中國(guó)），提取400μL血清中的游離DNA。取得的DNA溶解于去離子雙蒸餾水，置－20℃保存。

1.2.2 亞硫酸氫鹽修飾DNA 使用紫外分光光度法測(cè)定血清游離DNA濃度，取500ng DNA使用EZ DNA Methylation－Gold Kit（ZYMO RESEARCH，USA），按試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾和純化。經(jīng)此步驟獲得的DNA序列被修飾，未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶（C）保持原樣。修飾后DNA用15μL去離子雙蒸餾水溶解，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MSP 按照修飾后的序列設(shè)計(jì) RASSF1A、RUNX3、hmLH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2基因甲基化引物，按照不被修飾的序列設(shè)計(jì)非甲基化引物。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，序列及PCR產(chǎn)物片段大小詳見表1。PCR反應(yīng)體系由預(yù)混合的日本TaKaRa公司生產(chǎn)的Taq Hot Start Version試劑盒提供。加入10nM甲基化上下游引物，2 μL經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA模板，總反應(yīng)體積20μL。同時(shí)再取修飾后的DNA 2μL，同樣的反應(yīng)體系，加入10nM非甲基化上下游引物。反應(yīng)均為94℃預(yù)變性5min；共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，變性94℃30s，退火溫度詳見表1，退火時(shí)間30s，延伸72℃30s；最后72℃延伸5min。每批測(cè)定均使用甲基化酶SssI修飾的和未被修飾的正常血清游離DNA作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，用無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照。最后取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。以甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶作為甲基化陽(yáng)性的標(biāo)志。將僅非甲基化特異性引物擴(kuò)增出條帶作為甲基化陰性的標(biāo)志。PCR儀使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI 9700。

表1 甲基化及非甲基化引物序列、產(chǎn)物片段及退火溫度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.02統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清6種抑癌基因甲基化檢測(cè)結(jié)果比較 血清RASSF1A、RUNX3、hmLH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2基因啟動(dòng)子超甲基化在胃癌組陽(yáng)性率分別為21.9%（7／32），40.6%（13／32），21.9% （7／32），34.4% （11／32），28.1% （9／32），28.1%（9／32）；萎縮性胃炎組分別為3.5%（1／29），13.8%（4／29），0.0%（0／29），6.9%（2／29），3.5%（1／29），6.9%（2／29）；對(duì)照組僅有1例檢出RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.5%。6種基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率胃癌組均明顯高于萎縮性胃炎組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 聯(lián)合6個(gè)血清抑癌基因超甲基化對(duì)胃癌診斷的價(jià)值 血清 RASSF1A、RUNX3、hmLH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2單個(gè)基因啟動(dòng)子超甲基化對(duì)胃癌的診斷靈敏度為21.9%～40.6%；特異性為91.5%～100.0%。胃癌組中至少檢出1個(gè)基因甲基化陽(yáng)性的有23例，聯(lián)合血清中6種基因啟動(dòng)子甲基化可使診斷靈敏度提高，達(dá)到76.7%。聯(lián)合6種基因啟動(dòng)子超甲基化特異性為86.4%，與RUNX3啟動(dòng)子超甲基化測(cè)定特異性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與 RASSF1A、hm－LH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2單個(gè)基因啟動(dòng)子超甲基化測(cè)定比較有所降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 聯(lián)合檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)對(duì)胃癌診斷性能比較

3 討 論

胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命。雖然目前胃癌發(fā)生的機(jī)制仍不明確，但陸俊駿等［2］總結(jié)了表觀遺傳學(xué)的多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，胃癌的發(fā)生常伴隨抑癌基因啟動(dòng)子的超甲基化，且早于胃癌病理學(xué)的改變。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，將活性甲基從S－腺苷－2－甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶5位碳原子上，形成5－甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過(guò)程。超甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過(guò)程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件，甲基化使抑癌基因失活、表達(dá)下降，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［12］。目前認(rèn)為抑癌基因啟動(dòng)子的超甲基化是除缺失、突變等DNA序列發(fā)生變化以外導(dǎo)致基因功能發(fā)生變化的重要原因［2］。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者匯總以往研究，總結(jié)了包括本實(shí)驗(yàn)研究的6個(gè)基因等數(shù)十個(gè)基因的超甲基化與胃癌有關(guān)，在胃癌組織中的陽(yáng)性率較高，對(duì)胃癌的發(fā)生和演化過(guò)程意義重大［2，11，13］。本實(shí)驗(yàn)研究的RASSF1A基因有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是一種潛在的Ras癌蛋白效應(yīng)分子，能與活化的Ras結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡及細(xì)胞周期信號(hào)通路作用，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老的作用［4］。RUNX3基因通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）的生物活性，參與細(xì)胞分化、周期調(diào)控、凋亡和阻止細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化［5］。hmLH1基因作為DNA錯(cuò)配修復(fù)的重要基因，其表達(dá)下降導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)缺陷，產(chǎn)生DNA微衛(wèi)星參與癌癥的發(fā)生［6］。p16基因在細(xì)胞增殖中起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用，其表達(dá)下降可使細(xì)胞無(wú)限制地過(guò)度增殖，使G1期未充分發(fā)育的細(xì)胞提前進(jìn)入S期，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［11］。E－Cadherin基因?qū)S持細(xì)胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附具有重要作用，通過(guò)限制腫瘤細(xì)胞的侵襲行為來(lái)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。TFPI－2基因能抑制腫瘤細(xì)胞分泌的多種絲氨酸蛋白酶，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，具有抗腫瘤和抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能［9］。以上6種抑癌基因與胃癌的關(guān)系相繼被報(bào)道，這些基因啟動(dòng)子超甲基化多見于胃癌組織，引起基因表達(dá)下降，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展［4－11］。

腫瘤相關(guān)的突變基因通過(guò)腫瘤細(xì)胞凋亡釋放或腫瘤細(xì)胞直接入血的方式，被釋放到外周血中，因此能從血清中能檢測(cè)到腫瘤相關(guān)的特異性DNA［14］。較多學(xué)者采用 MSP方法檢測(cè)超甲基化，其具有較高靈敏度，是一種簡(jiǎn)便有效的方法［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，能通過(guò)MSP方法測(cè)定胃癌患者血清中抑癌基因啟動(dòng)子的超甲基化。在胃癌組血清中檢出RASSF1A、RUNX3、hmLH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2基因啟動(dòng)子超甲基化的陽(yáng)性率分別為21.9%，40.6%，21.9%，34.4%，28.1%，28.1%，明顯高于萎縮性胃炎組和對(duì)照組中的檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6種基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在萎縮性胃炎的陽(yáng)性率很低，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而以往的研究顯示，抑癌基因甲基化從正常、萎縮性胃炎、胃癌的發(fā)展逐漸增加，是胃組織發(fā)生癌變前的早期事件［16］。但萎縮性胃炎患者血清中的檢出率較低，推測(cè)這種現(xiàn)象可能與血清超甲基化的抑癌基因量較少有關(guān)。而腫瘤細(xì)胞的凋亡速度比較快及腫瘤細(xì)胞隨血液轉(zhuǎn)移進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致釋放到循環(huán)血液中的DNA量較多。推測(cè)血清中抑癌基因甲基化的測(cè)定，受到抑癌基因超甲基化的發(fā)生和組織細(xì)胞釋放DNA進(jìn)入血循環(huán)的量的影響。陸俊駿等［2］認(rèn)為晚期腫瘤釋放到循環(huán)血液中的DNA更多，且與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明血清抑癌基因超甲基化在腫瘤轉(zhuǎn)移和病情監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用前景不容忽視。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的血清6種抑癌基因超甲基化在胃癌組中的陽(yáng)性率為21.9%～40.6%，單獨(dú)1個(gè)基因超甲基化對(duì)胃癌診斷的靈敏度不高。陸俊駿等［2］也認(rèn)為胃癌及其癌前病變存在多個(gè)基因的變化，單個(gè)基因的改變只存在于一部分腫瘤中，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。但有76.7%的胃癌組患者至少檢出1個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化，多個(gè)基因超甲基化聯(lián)合檢測(cè)明顯提高了對(duì)胃癌診斷的靈敏度。聯(lián)合6項(xiàng)血清抑癌基因超甲基化診斷的特異性降為86.4%，說(shuō)明6項(xiàng)基因啟動(dòng)子超甲基化聯(lián)合檢測(cè)更具使用價(jià)值，是一種無(wú)創(chuàng)的，有效的腫瘤篩選新方法。

目前通過(guò)5－氮胞苷（5－Aza－CdR）等去甲基化藥物恢復(fù)抑癌基因的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)抑癌基因功能越來(lái)越得到臨床重視［17］。Yamashita等［18］的研究篩選啟動(dòng)子超甲基化的胃癌細(xì)胞株，通過(guò)5－Aza－CdR處理后，DNA的甲基化均得到逆轉(zhuǎn)，抑癌基因重新表達(dá)。但5－Aza－CdR不良反應(yīng)大，臨床應(yīng)用應(yīng)謹(jǐn)慎。血清抑癌基因的測(cè)定，能為選擇靶向藥物，監(jiān)測(cè)藥物療效提供新的依據(jù)，在胃癌個(gè)性化治療和療效監(jiān)測(cè)方面意義重大。

綜上所述，通過(guò)MSP能從胃癌患者血清中檢測(cè)到RASSF1A、RUNX3、hmLH1、P16、E－Cadherin、TFPI－2基因啟動(dòng)子超甲基化，陽(yáng)性率高于萎縮性胃炎患者及健康對(duì)照者。6個(gè)基因啟動(dòng)子超甲基化聯(lián)合測(cè)定較單獨(dú)測(cè)定靈敏度更高，可作為篩選腫瘤的分子標(biāo)志物進(jìn)行胃癌早期診斷。在甲基化藥物療效預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)方面也具有很大的應(yīng)用前景。為胃癌的診斷、治療以及預(yù)后判斷提供了新的方法或依據(jù)。

［1］張麗麗，吳建新.DNA甲基化－－腫瘤產(chǎn)生的一種表觀遺傳學(xué)機(jī)制［J］.遺傳，2006，28（7）：880－885.

［2］陸俊駿，錢燁，連強(qiáng).胃癌遺傳學(xué)及表遺傳學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（19）：43－46.

［3］Sato F，Meltzer SJ.CpG island hypermethylation in progression of esophageal and gastric cancer［J］.Cancer，2006，106（3）：483－493.

［4］Wang YC，Yu ZH，Liu C，et al.Detection of RASSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients［J］.World J Gastroenterol，2008，14（19）：3074－3080.

［5］趙丹，鄭威強(qiáng)，張萬(wàn)里.外周血RUNX3基因甲基化在胃癌中的臨床價(jià)值［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（18）：2451－2452，2453.

［6］吳安城，劉希雙，楊堃.錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1甲基化與胃癌的關(guān)系［J］.世界華人消化雜志，2008，16（13）：1407－1411.

［7］Tamura G.Alterations of tumor suppressor and tumor－related genes in the development and progression of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12（2）：192－198.

［8］姜蕊，趙春明，宋美娟，等.胃癌組織中E－cadherin基因啟動(dòng)子異常甲基化狀態(tài)觀察［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（50）：4－6.

［9］Takada H，Wakabayashi N，Dohi O，et al.Tissue factor pathway inhibitor 2（TFPI2）is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，2010，197（1）：16－24.

［10］呂萍，凌志強(qiáng)，余江流，等.胃癌組織中p16基因甲基化狀態(tài)及臨床意義［J］.腫瘤學(xué)雜志，2013，19（5）：332－335.

［11］趙成海，張寧，卜獻(xiàn)民，等.胃癌多基因甲基化狀態(tài)分析［J］.世界華人消化雜志，2006，14（10）：1004－1007.

［12］朱正綱，傅國(guó)輝，劉炳亞，等.分子標(biāo)志物在胃癌發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，32（9）：1185－1197.

［13］Suzuki H，Tokino T，Shinomura Y，et al.DNA methylation and cancer pathways in gastrointestinal tumors［J］.2008，9：1917－1928.

［14］馬曉杰，李景鵬，趙勇.血漿中游離核酸：分子診斷的新靶點(diǎn)［J］.生命的化學(xué)，2006，26（2）：147－149.

［15］范保星.DNA甲基化檢測(cè)方法［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè)，2002，25（2）：99－101.

［16］Qu YP，Dang SW，Hou P.Gene methylation in gastric cancer［J］.Clinica Chimica Acta，2013，42（4）：53－65.

［17］周建生，楊生生，繆明永，等.DNA甲基化／去甲基化與癌癥［J］.生命的化學(xué)，2013（4）：381－388.

［18］Yamashita S，Tsujino Y，Moriguchi K，et al.Chemical genomic screening for methylation－silenced genes in gastric cancer cell lines using 5－aza－2＇－deoxycytidine treatment and oligonucleotide microarray［J］.Cancer Sci，2006，97（1）：64－71.