高效液相色譜法測(cè)定血漿中烏頭堿的含量

曹海瑩

黑龍江省慶安縣公安局，黑龍江 慶安 152400

烏頭類中藥因其具有治療風(fēng)濕痹證、跌打損傷等顯著療效，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床。川烏、草烏和雪上一支蒿等烏頭屬中草藥均含有烏頭堿類成分［1-2］，既是烏頭類中藥的有效成分又是毒性成分，其安全范圍窄，治療量與中毒量接近，同時(shí)由于患者的個(gè)體差異，對(duì)其耐受性不一，常引起誤服中毒或投毒［3-4］。由于烏頭堿中毒無特異性臨床表現(xiàn)，難以對(duì)其進(jìn)行中毒鑒別，建立血漿中烏頭堿的測(cè)定方法對(duì)法醫(yī)鑒定及臨床診斷具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀 (LC-6A泵，SCL-6B系統(tǒng)控制箱，Anastar色譜工作站);離心機(jī)(SANYO);YKH-1型液體快速混合器;PB153-S型電子分析天平 (瑞典梅特勒-托利多)。

1.2 藥品與試劑 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品 (批號(hào):110720-200410，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);乙晴為色譜純，水為雙蒸水。其余試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 血液樣品的前處理 在經(jīng)志愿者同意后，采取靜脈血2ml置于離心管中，3000r/min離心，取血漿 0.5ml加0.5ml氨水混勻后加入4ml乙醚震蕩萃取，提取10min后置于離心機(jī)上3000r/min離心5min，吸取上清液3ml于試管中，用N2吹干后加入0.4ml甲醇備用。

2.2 色譜條件 色譜分離柱:Hypersil ODS2(4.6mm，200mm);流動(dòng)相:0.005mol/L溴化四丁銨:乙晴=65∶35(v/v);檢測(cè)波長(zhǎng):235nm;流速:1ml/min;進(jìn)樣量:20μl;柱溫:32℃。

2.3 實(shí)驗(yàn)溶液的配制 精密稱取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品1000μg，置于2ml容量瓶中，加入純凈水定容，精密配制成為500μg/ml的烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。0.005mol/L溴化四丁銨水溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照參考文獻(xiàn)將烏頭堿對(duì)照品配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg/ml 不同濃度溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以色譜峰面積與血漿濃度計(jì)算線性回歸方程，即Y=190354X+69984，其相關(guān)系數(shù)r=0.9997，線性范圍 0.1-5.0μg/ml。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 將配置的 0.2、0.8、3.2μg/ml的烏頭堿溶液，按本文所述條件檢測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)6次，以烏頭堿色譜峰面積計(jì)算其RSD為0.19%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將配置的0.8μg/ml的烏頭堿溶液按本文所述條件檢測(cè)，每間隔2h檢測(cè)一次，其RSD為0.68%，12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取0.2μg/ml的烏頭堿溶液3份，每份分別加對(duì)照溶液，以烏頭堿色譜峰面積計(jì)算其平均回收率，去其平均回收率為98.8%。

2.8 樣品測(cè)定 取口服附子藥酒及服用含附子中藥的志愿者的血漿100μl，共3批次，每個(gè)樣品測(cè)定3次，按本文所述條件方法測(cè)定色譜峰面積，測(cè)得樣品中烏頭堿的含量見表1。

3 應(yīng)用案例

死者男性，63歲。連續(xù)飲用自制高濃度藥酒，每次四兩左右，約30min后相繼發(fā)生口、唇、舌、四肢發(fā)麻等癥狀，經(jīng)搶救無效后死亡。法醫(yī)尸檢提取死者血漿和所引藥酒送檢，采用上述HPLC法進(jìn)行測(cè)定，所飲藥酒和死者血漿中均檢出烏頭堿成分。死者血漿中烏頭堿濃度為0.22μg/ml，藥酒中烏頭堿濃度為 53.2μg/ml。死者飲用該藥酒在200ml以上，實(shí)際攝入烏頭堿的量已大于1.064×104μg，超出成人口服烏頭堿致死量，本案應(yīng)系烏頭堿急性中毒死亡。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

含有烏頭堿的中藥在中醫(yī)臨床中大量應(yīng)用，由于其毒性較強(qiáng)，常有烏頭堿中毒的事件發(fā)生。本文對(duì)采自口服附子藥酒及口服含有附子的中藥湯劑的志愿者的血清進(jìn)行烏頭堿檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果具有烏頭堿檢出，雖低于烏頭堿中毒劑量，但其如長(zhǎng)期服用烏頭堿在體內(nèi)蓄積很可能引發(fā)其中毒。通過本文研究建議人們不要擅自服用含烏頭堿的藥酒或湯劑，必須服用時(shí)要在專業(yè)醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行，并隨時(shí)觀察身體反應(yīng)，如有不適及時(shí)就醫(yī)，防止其中毒發(fā)生［5-6］。文獻(xiàn)報(bào)道高效液相色譜法檢測(cè)烏頭堿，其準(zhǔn)確度、精密度和萃取回收率上都達(dá)到了生物分析的要求，能滿足法醫(yī)毒物分析［7-8］。該分析方法血漿用量少，樣品處理方法簡(jiǎn)單，減少了烏頭的分解和損失環(huán)節(jié)，提高了檢出率。若待測(cè)血中烏頭堿含量較低時(shí)，可通過增大取樣量或減小定容體積等手段來富集。

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