保暖風(fēng)的薄層色譜鑒別及其紫丁香苷HPLC法含量測(cè)定

唐秀玲 唐秀利

1.廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021;2.廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院，廣西 柳州 545007

保暖風(fēng)為傳統(tǒng)瑤藥“五虎九牛十八鉆七十二風(fēng)”之風(fēng)藥，來(lái)源為瑞香科植物結(jié)香Edgeworthia chrysantha Lindl.的全株［1］。分布河南、陜西、長(zhǎng)江流域及以南各省區(qū)，廣西各地均有分布［1-3］。保暖風(fēng)味甘、性溫，歸腎、肝經(jīng)，其根、莖、花可分別人藥，根和莖具有舒筋活絡(luò)，消腫止痛功效;花具有養(yǎng)陰安神、明目、祛障翳之功效［4］。為保護(hù)、收集、整理和發(fā)展廣西民間瑤藥資源，廣西食品藥品監(jiān)督管理局?jǐn)M出版《廣西瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (第一卷)》，對(duì)瑤族習(xí)用藥材進(jìn)行質(zhì)量控制指標(biāo)研究，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保暖風(fēng)是其中品種之一。

保暖風(fēng) (結(jié)香)化學(xué)成分研究報(bào)道［4-6］主要含香豆素類、黃酮類、甾類、有機(jī)酸化合物等，其中傘型花內(nèi)酯、西瑞香素等成分含量測(cè)定方法已有報(bào)道［7］。本文采用7-羥基香豆素、紫丁香苷對(duì)照品及保暖風(fēng)對(duì)照藥材作薄層色譜鑒別的對(duì)照，建立兩個(gè)薄層色譜鑒別，結(jié)果斑點(diǎn)圓整、清晰，重復(fù)性好;用高效液相色譜法測(cè)定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制備供試品，用乙腈-水 (9∶91)為流動(dòng)相，紫丁香苷與其它雜質(zhì)峰分離良好，按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄［8］“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可作為保暖風(fēng)質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站;MILLIPORE純水處理器;MIKRO 22R型高速冷凍離心機(jī);梅特勒電子分析天平。

1.2 試藥 7-羥基香豆素 (批號(hào):11739-200501)、紫丁香苷 (批號(hào):111574-200201)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純。保暖風(fēng)分別采集于廣西金秀縣桐木鎮(zhèn)、資源縣兩水鄉(xiāng)、賀州市開(kāi)山鎮(zhèn)、金秀縣長(zhǎng)垌鄉(xiāng)、桂林市、金秀縣六巷鄉(xiāng)，柳州市鹿寨縣、桂林市龍勝縣、桂林市恭城縣等地，經(jīng)鑒定為瑞香科植物結(jié)香Edgeworthia chrysantha Lindl。

2 薄層色譜鑒別

2.1 7 -羥基香豆素的鑒別 取保暖風(fēng)粉末1g，加甲醇30ml，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風(fēng)對(duì)照藥材1g，同法制定對(duì)照藥材溶液，再取7-羥基香豆素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液2～4μl、對(duì)品溶液1～2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚 (60～90℃)-乙酸乙酯 (6.5∶3.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色和對(duì)照品譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.2 紫丁香苷的鑒別 取本品各2g，加甲醇50ml，超聲30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml使溶解，加石油醚 (60～90℃)提取兩次，每次25ml，棄去石油醚液，再加三氯甲烷提取兩次，每次25ml，棄去三氯甲烷液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風(fēng)對(duì)照藥材2g，同法制定對(duì)照藥材溶液，再取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液5～10μl、對(duì)品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸 (6∶1.2∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置紫外燈 (254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色和對(duì)照品譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

3 紫丁香苷含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm×250mm);檢測(cè)波長(zhǎng):264nm;流速:1.0ml/min;柱溫:35℃，流動(dòng)相:乙腈-水 (9∶91)，進(jìn)樣量10μl。在上述色譜條件下，紫丁香苷峰形良好，與相鄰峰達(dá)到基線分離。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取紫丁香苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.3 穩(wěn)定性考察 對(duì)同一供試品溶液 (BNF-5)，每隔一定時(shí)間測(cè)定一次，共測(cè)定9次，RSD為0.95%。試驗(yàn)表明，在24小時(shí)內(nèi)被測(cè)物穩(wěn)定。

3.4 線性范圍考察 精密稱取紫丁香苷對(duì)照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取 1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分 別 置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10μl，按3.1色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) (X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明:紫丁香苷進(jìn)樣量在0.04132～2.066μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=2.5173×106X-3.0990×103，r=1.0000。

3.5 精密度試驗(yàn)

3.5.1 儀器精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液 (BNF-5)，按“3.1”色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果6次測(cè)定結(jié)果紫丁香苷峰面積的平均值為902489，RSD為0.49%(n=6)。試驗(yàn)表明，本法的精密度良好。

3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品 (BNF-5)，按擬訂的方法平行測(cè)定6份，結(jié)果紫丁香苷含量的平均值為1.76mg/g，RSD為1.6%(n=6)。果表明本法的重復(fù)性好。

3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取已知含量的保暖風(fēng)0.5g(BNF-5，紫丁香苷含量為1.7622mg/g)，共六份，分別精密加入紫丁香苷甲醇溶液 (紫丁香苷含量0.7710mg/ml)1ml，揮去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果紫丁香苷的加樣回收率為101.2%，RSD=1.3%(n=6)，符合方法學(xué)的要求，詳見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.7 耐用性考察 用不同品牌色譜柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm × 250mm)、Alltima C18(5μm，4.6mm ×250mm)、XBridge C18(5μm，4.6mm ×250mm)進(jìn)行分離、測(cè)定，結(jié)果紫丁香苷在上述色譜柱中均得到良好的分離，理論板數(shù)分別為5638、10368、5763。平均含量分別為1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD為0.56%。

3.8 樣品測(cè)定 按“3.2.1”、“3.2.2”制備對(duì)照品溶液和10批樣品溶液，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按干燥品計(jì)算樣品中的紫丁香苷的含量。10批樣品中含量最高的是BNF-5為0.196%;含量最低的是BNF-6為0.023%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 供試品溶液制備方法的確定 本研究采用單因素試驗(yàn)，對(duì)提取溶劑 (甲醇、乙醇)、提取方法 (超聲、回流)、提取溶劑的量 (15、25、50、100ml)和提取時(shí)間(15、30、60、90、120mim)依次進(jìn)行考察，結(jié)果表明，甲醇25ml，加熱回流30分鐘，可提取完全。

4.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取紫丁香苷對(duì)照品溶液及供試品溶液，按以上色譜條件進(jìn)樣，在反相高效液相色譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)對(duì)紫丁香苷的分離后，以二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定它的紫外光譜圖，結(jié)果紫丁香苷對(duì)照品與保暖風(fēng)樣品均在221nm和264nm處有最大吸收，由于221nm干擾較大，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為264nm。

4.3 所建立的薄層色譜方法及含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便快捷，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能有效控制保暖風(fēng)的質(zhì)量，可作為保暖風(fēng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要控制指標(biāo)。

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