甘露糖結合凝集素基因多態性與中樞神經系統脫髓鞘疾病的關系分析

胡 瑾 張曉麗 蘇 華 趙麗敏 趙雪聰 郜 岳

1.河北北方學院第一附屬醫院神經內科，河北張家口 075000；2.河北北方學院電鏡室，河北張家口 075000；3.河北北方學院第一附屬醫院檢驗科，河北張家口 075000

中樞神經系統脫髓鞘疾病是臨床上較為常見的 一組疾病，在病理上以中樞神經系統多灶性脫髓鞘、炎癥為主，病因上與自身免疫相關的一組臨床疾病，病因復雜，至今尚未闡明。甘露糖凝集素（mannosebinding lectin，MBL）是人體內重要的天然抗感染免疫分子[1]，若MBL發生基因突變，則會導致缺損或異常，機體對外界病原體的易感性則發生變化，從而影響先天免疫能力。MBL與炎癥、自身免疫性疾病和抗感染免疫等關系密切[2-4]。本研究利用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性分析的方法，觀察中樞神經系統脫髓鞘患者MBL基因第54號密碼子多態性分布，探討MBL基因多態性與中樞神經系統脫髓鞘疾病之間的關系?，F報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集 2009年 1月～2012年 12月河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）神經內科患中樞神經系統脫髓鞘疾病病例45例（疾病組），其中男18例，女 27 例，發病年齡為 12～72 歲，平均（38.2±2.6）歲。 其診斷按照1983年Poser提出的診斷標準[5]。對照組為來我院進行體檢的健康人員（健康對照組），共計60例，其中男 38例，女 22例，年齡為 25～65歲，平均（43.6±5.2）歲，無免疫病史和嚴重感染史。本研究經我院倫理委員會通過，研究對象知情同意并簽署知情同意書。兩組一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 樣本的收集及處理

疾病組在入院當天采集靜脈血，健康對照組在體檢當日抽取靜脈血，均隨機進行編號。采用EDTA-K2抗凝管收集靜脈血。將部分靜脈血放入離心管中進行離心，離心10 min，轉速10 000 r/min，分離出血漿，放入EP管中，-80℃保存。

另取部分血液采用DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）進行提取備用。即：取1 mL抗凝靜脈血，在樣品中加入3 mL紅細胞裂解液 ，顛倒混勻，室溫放置5 min，期間再顛倒混勻幾次。10 000 r/min離心1 min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻。加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min。加入200 μL無水乙醇，充分震蕩15 s，所得溶液加入吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，向吸附柱 CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液，向吸附柱 CB3中加入 600 μL漂洗液 PW，12 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，然后置于室溫放置數分鐘，將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3 方法

采用河北北方學院賈天軍等[6]建立的MBL ExonⅠ54位基因突變檢測方法進行操作。PCR擴增目的DNA：引物：5′-AGGGCATGCTCGG-TAAAT-3′、5′-CTCATATCCCCAGGCAGTT-3′。凝膠圖像分析系統拍照，記錄。

1.4 統計學方法

計算出中樞神經系統脫髓鞘疾病組和對照組MBL基因的各種基因型頻率和等位基因頻率，使用SPSS 12.0軟件包進行數據統計處理，利用卡方檢驗，分析MBL在各組間的差別，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在所檢測到的45例中樞神經系統脫髓鞘疾病患者甘露糖凝集素基因ExonⅠ 54位密碼子點突變中，野生型（GGC/GGC）為 34例，占 75.56%；突變雜合子型（GGC/GAC）為 10例，占 22.22%；突變純合子型（GAC/GAC）為 1例，占 2.22%。基因頻率：GGC 為86.67%，GAC為13.33%。對照組野生型（GGC/GGC）為30例，占50.00%；突變雜合子型 （GGC/GAC）為28例，占46.67%；突變純合子型（GAC/GAC）為 2例，占3.33%?；蝾l率：GGC為73.33%，GAC為26.67%。兩組基因點突變頻率比較，中樞神經系統脫髓鞘疾病患者GGC/GGC基因型頻率增高，而GGC/GAC基因型頻率降低，差異均有顯著性；中樞神經系統脫髓鞘疾病患者GGC等位基因頻率高于健康對照組，而GAC等位基因頻率低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 中樞神經系統脫髓鞘疾病組、健康對照組基因點突變頻率的比較

3 討論

MBL是一種C型凝集素，屬于 Ca2+依賴型凝集素，是一種與先天免疫防御相關的血清凝集素，廣泛存在于人和動物體內。人的MBL基因定位于10號染色體長臂上（10q11.2～q23），長約 7 kb，含有 3 個內含子，4個外顯子，cDNA全長約 30 kb，有4個編碼區，包括mbl1和mbl2兩個基因，但mbl1是一種假基因，mbl2是人們通常說的MBL基因。人的MBL多以二聚物、三聚物和四聚物的形式存在。MBL主要由肝細胞產生，經分泌入血，其存在形式有兩種，一是游離存在，另一種是與細胞膜結合，以膜結合蛋白形式存在，膜結合蛋白型廣泛分布于白細胞、枯否細胞、血小板、內皮細胞、巨噬細胞等。這種分布形式與MBL的先天免疫反應功能有關。它能夠識別糖配體，啟動補體系統活化系統，促進吞噬、免疫調節作用，抑制、中和病毒作用，也是精卵識別的信號受體之一。

MBL作為機體的防御屏障，在保護機體，抵抗致病菌的入侵方面發揮了重要作用。MBL發揮免疫防御功能依賴于其在血清中的濃度和四級結構的多聚形式，血清中MBL水平降低將導致機體調理吞噬功能低下，易患感染性疾病。薛玉瑋等[7]報道在系統性紅斑狼瘡患者血清MBL水平顯著低于健康志愿者，特別是活動期系統性紅斑狼瘡患者血清MBL水平降低尤為明顯，而且血清 MBL水平較低的患者更易發生比較嚴重的感染。

MBL基因結構區變異及啟動子區基因不同的調節活性將影響血液循環中MBL水平，MBL基因點突變導致有功能的MBL分子血清水平大大降低，將導致調理缺陷，先天性免疫力削弱。機體易遭病原體侵襲；另一方面，其激活補體級聯反應，而補體活化又可能造成自生組織損傷。因此，MBL與臨床許多疾病密切相關，近年來國內外學者研究MBL水平降低與克隆氏病，1、2型糖尿病，呼吸道感染和類風濕性關節炎等疾病有關[2，4，8-12]。 血清中 MBL含量較低者終生處于高度的感染風險之中，隨時可感染各種疾病，甚至威脅生命。

中樞神經系統脫髓鞘疾病是以中樞神經系統炎性、多灶性脫髓鞘為主的自身免疫系統疾病，以反復發作，多次緩解、復發為特征。嚴重危害人體健康，盡管許多年來國內外學者對其進行了大量深入地研究，但其病因及發病機制迄今仍未闡明。因MBL與自身免疫性疾病中的關系非常密切，筆者采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）法檢測了45例中樞神經系統脫髓鞘疾病和60例健康志愿者的MBL基因多態性的分布，結果顯示中樞神經系統脫髓鞘疾病組GGC/GGC基因型頻率增高，而GGC/GAC基因型頻率降低，差異均有顯著性；中樞神經系統脫髓鞘疾病患者GGC等位基因頻率高于健康對照組，而GAC等位基因頻率低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明MBL基因突變與中樞神經系統脫髓鞘疾病發病有關，可能是該病發生的危險因素。

MBL與中樞神經系統脫髓鞘疾病的發生密切相關，隨著對MBL的深入研究，對進一步揭示中樞神經系統脫髓鞘疾病的發病機制將起到積極作用。如何控制血漿中MBL的濃度水平來治療中樞神經系統脫髓鞘等自身免疫性疾病，這將為攻克這類頑癥提供新的思路。

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