桑蒂復肝膠囊對D-半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護作用*

1 材料

1.1 實驗動物昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體質量 (20±2)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK2002-005.046。

1.2 藥物和試劑桑蒂復肝膠囊清膏，1 mL含生藥2.2 g;D-GlaN(Sigma公司，臨用前取1.68 g，用生理鹽水溶解，再用1 mol/mL的NaOH溶液調節至7.0，然后再加生理鹽水15 mL配置成10%濃度);聯苯雙酯滴丸 (浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號:060705);乙肝解毒膠囊 (武漢健民集團隨州藥業有限公司，批號:060203);SOD、MDA試劑盒 (南京建成生物研究所，批號:20060810)。

1.3 主要儀器設備低速離心機:上海安亭科學儀器廠;Nikon DXMF1200顯微鏡 (Nikon公司);7600-020型全自動生化分析儀 (日立公司)。

2 方法［1－2］

昆明種小鼠98只，適應性喂養3天后，分別秤重標記，隨機分組為:空白對照組、模型組、桑蒂復肝膠囊高、中、低劑量組、聯苯雙酯組、乙肝解毒膠囊組，每組14只。桑蒂復肝膠囊高、中、低劑量組分別按照14.28、7.14、3.57 g/kg劑量灌胃;乙肝解毒膠囊組按內容物0.9 g/kg劑量灌胃給藥;聯苯雙酯組以200 mg/kg劑量灌胃給藥;空白組和模型組以純凈水灌胃。每天給藥1次，連續5天，給藥容積為20 mL/kg。第5天灌胃給藥后1 h，按D-GlaN劑量1 g/kg給小鼠腹腔注射1次造模，小鼠禁食不禁水。24 h后，全部小鼠摘眼球取全血，以2 000 r/min速度離心10 min分離得血清，用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平。取肝臟，在肝左葉同一部位剪取一小塊肝組織放置10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病變程度 (病變程度分別以“+++”、“++”、“+”、“-”表示，“+++”表示重度肝細胞水腫，肝細胞片狀壞死，大量炎細胞浸潤;“++”表示中度肝細胞水腫，肝細胞灶狀壞死，或明顯炎細胞浸潤; “+”表示輕度肝細胞水腫，散在肝細胞點狀壞死，少許炎細胞浸潤;“-”表示肝組織無水腫，無壞死，無炎細胞浸潤)。剩余肝臟用4℃生理鹽水漂洗后放置于-80℃冰箱，測試前取肝臟，稱量，加生理鹽水，肝臟重量和生理鹽水體積按1︰9的比例，在冰浴中制備10%肝組織勻漿，4℃3 000 r/min離心15 min，取上清液。按試劑盒操作說明測定上清液中SOD、MDA含量。

3 結果

3.1 桑蒂復肝膠囊對D-GlaN致急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST的影響模型組小鼠血清中ALT、AST升高明顯，與空白對照組比較差異有非常顯著性 (P＜0.01)，說明造模成功。桑蒂復肝膠囊各劑量組ALT水平明顯降低，與模型組比較，差異有顯著性;桑蒂復肝膠囊高、中劑量組和聯苯雙酯組AST水平與模型組相比，差異有顯著性(P ＜0.01或P ＜0.05)。詳見表1。

3.2 桑蒂復肝膠囊對D-GlaN致急性肝損傷小鼠肝組織勻漿MDA、SOD的影響與模型對照組比較，桑蒂復肝膠囊高、中劑量組肝組織中SOD活性明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，差異有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表1。

表1 桑蒂復肝膠囊對血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA、SOD的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別動物數 (只)劑量 (g/kg) ALT(U/L) AST(U/L) MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)空白對照組 12 - 59.4±23.8＊＊ 116.4±65.4＊＊ 1.6±0.3＊＊ 132.7±9.7＊＊＊＊模型對照組 12 - 222.4±40.0 317.5±124.8 3.8±0.6 111.0±10.7聯苯雙酯組 11 0.20 127.1±36.7＊＊ 246.3±58.4* 2.4±0.6＊＊ 127.6±17.7*乙肝解毒組 12 0.90 171.0±32.9* 262.4±96.1 2.7±0.5* 124.6±18.1*低劑量組 11 3.57 170.2±38.7* 263.4±80.7 2.8±0.7 123.5±10.8中劑量組 10 7.14 154.7±39.3＊＊ 225.1±84.9* 2.6±0.5* 127.3±9.2*高劑量組 10 14.28 124.2±26.8＊＊ 204.9±69.2＊＊ 2.1±0.5＊＊ 130.5±12.9

3.3 桑蒂復肝膠囊對D-GlaN致急性肝損傷小鼠肝臟組織病理學改變的影響與模型對照組比較，桑蒂復肝膠囊高、中劑量組肝組織損傷積分較低，說明高、中劑量組的保肝作用較好，而低劑量組及乙肝解毒膠囊組肝組織損傷積分較高。說明桑蒂復肝膠囊可減輕D-GlaN肝損傷動物肝細胞變性、壞死，有一定程度對抗D-GlaN所致肝細胞病理損害作用。詳見表2。

表2 桑蒂復肝膠囊對肝臟組織病理學改變的影響(±s)

組別動物數(只)肝細胞水腫肝細胞壞死- + ++ +++ P值炎細胞浸潤- + ++ +++- + ++ +++＜0.05模型對照組 14 7 2 3 2 8 3 2 1 7 3 2 2聯苯雙酯組 14 10 2 1 1 12 1 1 0 11 1 1 1 P＜0.05乙肝解毒組 14 9 2 2 1 10 1 1 2 10 2 1 1低劑量組 14 7 4 2 1 8 3 1 2 8 2 2 2中劑量組 14 10 2 1 1 10 2 2 0 11 2 1 0 P＜0.05高劑量組 14 11 1 1 1 12 1 1 0 12 1 1 0 P＜0.05空白對照組 14 9 3 2 0 14 0 0 0 14 0 0 0 P

4 討論

D-GlaN復制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現出來的癥狀，肝功能檢測指標，肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性，是目前公認的比較好的研究病毒性肝炎的發病機制及有效治療藥物的實驗動物模型。［3］D-GlaN是肝細胞的磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，進入體內后與磷酸尿苷結合形成磷酸尿苷-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，導致核酸、糖、蛋白、脂類等物質合成受抑致，限制了細胞器及酶的生成和補充，細胞器受損、膜損害，鈣離子內流入細胞，從而造成肝細胞損傷，肌體對內毒素吸收增加、自由基的產生和脂質過氧化反應等也是D-GlaN致肝損傷的重要因素。［4］肝細胞內所含的酶是血清酶類的主要來源，整個肝內轉氨酶的量約為血清中的100倍，ALT主要存在于肝細胞的可溶部分，AST則存在于肝細胞的線粒體中，故血清中ALT和AST水平可敏感反映肝細胞膜的損傷狀況。［5］MDA為脂質過氧化的最終產物，可以破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹壞死，SOD是清除氧自由基的重要酶，具有清除超氧陰離子自由基，防止自由基對細胞結構的損傷，二者聯合檢測可以反應肌體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本文結果表明，桑蒂復肝膠囊對D-GlaN所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用，可以降低小鼠血清AST、ALT水平，提高肝組織勻漿SOD活力，降低MDA含量，減輕小鼠肝損傷組織的病理程度，其機制可能與其保肝降酶、清除自由基等有關。

［1］徐書云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛生出版社，1985.934-945

［2］劉耕陶.中藥藥理研究與新藥創新［M］.北京:中國協和醫科大學出版社，2001.1 226

［3］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛生出版社，1993.980

［4］王四旺，施新酋，黃傳貴，等.中藥藥效學研究與評價［M］.西安:陜西科學技術出版社，2005.351

［5］陳紫榕.病毒性肝炎［M］.北京:人民衛生出版社，2002.226