癃閉舒片提取工藝優(yōu)化和含量測定方法研究*

上海奧星制藥技術(shù)裝備有限公司 王國振 趙 海 張 闖 石 紅(上海201600)

癃閉舒片是由補骨脂 、益母草、金錢草、海金沙、琥珀及山慈菇六味藥物組成的復(fù)方制劑 ，原工藝采用琥珀原粉入藥，其余補骨脂等五味藥材加水煎煮，濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。該藥的君藥為補骨脂，其有效成分為補骨脂素和異補骨脂素，原工藝提取補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素收率偏低，因此對原工藝進行改進制得癃閉舒片。為了進一步控制其質(zhì)量，采用高效液相色譜法對制劑中補骨脂素和異補骨脂素含量進行了測定，現(xiàn)報道如下。

1 試藥與儀器

高效液相色譜儀 (UltiMate 3000美國DIONEX公司);N-2000色譜工作站 (浙江大學(xué));TU-1900紫外分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司);癃閉舒片 (石家莊科迪藥業(yè)有限公司);補骨脂素對照品 (批號:110739–200910，中國藥品生物制品檢定所);異補骨脂素對照品 (批號:110738-200811，中國藥品生物制品檢定所);乙腈和甲醇為色譜純;水為超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 色譜條件:色譜柱，Kromasil 100A C185 μm 4.6×250 mm;柱溫:室溫;流動相:甲醇-水 (55︰45);流速:1.0 mL/min;檢測波長:246 nm;理論塔板數(shù)以按補骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:補骨脂素分別配成5.2、10.4、20.8、41.6和83.2μg/mL溶液，異補骨脂素分別配成5.1、10.2、20.4、40.8和81.6 μg/mL溶液。分別精密量吸取上述對照品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，分別進樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積。以對照品進樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，得到:補骨脂的回歸方程為:Y=895 462X-16 859，r=0.999 9，在0.052～0.832 μg范圍內(nèi)，補骨脂素進樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系;異補骨脂的回歸方程為:Y=76 295X-86 904，r=0.999 9，在0.051～0.816 μg范圍內(nèi)，異補骨脂素進樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品的制備:取相當(dāng)于0.5 g藥材的提取液，蒸干，加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移置具塞容量瓶中，精密加甲醇至25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 單因素考察和正交優(yōu)化提取工藝 原工藝:補骨脂、益母草、金錢草、海金沙及山慈菇五味藥材加水煎煮，濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。新工藝:補骨脂單獨乙醇提取，回收乙醇至無醇味，備用;益母草、金錢草、海金沙及山慈菇四味藥材與補骨脂藥渣加水煎煮，濾液與上述濃縮液合并濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。

2.2.1 單因素考察:(1)提取次數(shù)對指標(biāo)成分影響，將提取時間固定為1 h，加乙醇量為8倍，分別提取1、2、3、4，5次，考察了不同提取次數(shù)對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果在提取3次以后，補骨脂素和異補骨脂素含量很少，因此最多提取3次。(2)提取時間對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，加乙醇量為8倍，每次分別提取0.5、1、1.5、2 h，考察了不同提取時間對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果每次提取1 h，補骨脂素和異補骨脂素含量基本提取完全，因此每次提取1 h。(3)溶劑用量對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，提取時間為1 h，每次分別加6、8、10、12倍量乙醇，考察了不同溶劑用量對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果溶劑用量對指標(biāo)成分影響不大，考慮生產(chǎn)成本，選擇8倍量乙醇。(4)乙醇濃度對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，提取時間為1 h，加8倍量乙醇，分別用50%、60%、70%、80%乙醇提取，考察了不同濃度的乙醇對指標(biāo)成分和出膏率的影響。綜合評價后70%乙醇提取效果基本完全。

2.2.2 正交設(shè)計篩選最優(yōu)提取工藝:稱取100 g補骨脂藥材9份，結(jié)合文獻及單因素預(yù)試驗，選定補骨脂素和異補骨脂素為考察指標(biāo)成分，運用正交試驗的方法，對主要影響因素:加乙醇量 (A)、時間 (B)、次數(shù) (C)、醇提濃度 (D)考察。

2.2.2.1 實驗設(shè)計:［1］運用正交設(shè)計試驗，以補骨脂素和異補骨脂素為考察指標(biāo)成分，結(jié)合文獻、工業(yè)生產(chǎn)及預(yù)試驗，確定4因素3水平，見表1。

表1 提取條件因素-水平設(shè)計

2.2.2.2 方法與結(jié)果:按表1設(shè)計操作，按供試品處理下列樣品即得。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

2.2.2.3 結(jié)果分析:對試驗結(jié)果進行方差分析，見表3。

表3 方差分析表

由表2直觀分析表可知，各考察因素對補骨脂素和異補骨脂素影響大小順序為C＞B＞D＞A;表3方差分析，表明提取時間和提取次數(shù)對補骨脂素和異補骨脂素的含量影響顯著，因此選擇提取3次，每次1.5 h;直觀分析，醇提濃度和溶劑用量對補骨脂素和異補骨脂素的含量影響不大。因此選擇醇提濃度為60%和80%時，含量相差不大，考慮生產(chǎn)成本，因此選定60%乙醇提取，溶劑用量選擇6倍量乙醇;因此，最后確定工藝為:回流提取3次，每次1.5 h，每次加6倍量乙醇，醇提濃度為60%。并驗證結(jié)果，見表4。

表4 工藝比較表

提取工藝確定:補骨脂單獨乙醇提取，回收乙醇至無醇味，備用;益母草、金錢草、海金沙及山慈菇四味藥材與補骨脂藥渣加水煎煮，濾液與上述濃縮液合并濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。

2.3 成品中補骨脂素與異補骨脂素含量測定［2］

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性:色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;柱溫，25℃;流動相，乙腈-水 (32︰68);流速，1.0 mL/min;檢測波長，246 nm。理論板數(shù)按補骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.3.2 干擾性試驗:按照處方制備不含補骨脂的陰性樣品，按擬定的含量測定方法制備陰性對照液，進樣分析，結(jié)果在對照品溶液和供試品溶液補骨脂素和異補骨脂素峰相同保留時間位置陰性未見有峰干擾，說明癃閉舒片中其他藥材及輔料對本方法測定補骨脂素和異補骨脂素的含量無干擾。

2.3.3 線性關(guān)系試驗: (1)對照品溶液制備，分別取補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 μg/mL的溶液;分別取異補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為2.7、5.4、10.8、21.6、43.2 μg/mL的溶液，分別吸取上述兩種對照品溶液下不同濃度補骨脂素異和補骨脂素10 μL，進樣分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上述色譜條件下，記錄色譜圖，測定峰面積。以補骨脂素和異補骨脂素對照品進樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，得到:①補骨脂素回歸方程為，Y=171 627X-25 325，r=0.999 9，在 0.026 ～0.416 μg范圍內(nèi)，補骨脂素進樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。②異補骨脂素回歸方程為，Y=324 556X-187 905，r=0.999 9，在 0.027 ～0.432 μg范圍內(nèi)，異補骨脂素進樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗:精密吸取含補骨脂素和異補骨脂素分別為10 μg/mL的對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定其峰面積，結(jié)果見表5、表6。

表5 補骨脂素對照品精密度試驗結(jié)果

表6 異補骨脂素對照品精密度試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明:精密度良好，補骨脂RSD為0.39%，異補骨脂RSD為1.3%。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗: 稱取樣品約0.3 g，精密稱定，照確定的方法制備供試品溶液，取上述供試液，分別于0、2、4、8和14 h時，進樣10 μL，測得樣品中補骨脂素和異補骨脂素峰面積，結(jié)果見表7、表8。

表7 供試品溶液補骨脂素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表8 供試品溶液異補骨脂素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果證明，樣品溶液在14 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗:按擬定的含量測定方法，對同一批樣品，分別制備5份供試品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積值總和并計算含量，結(jié)果見表9。

表9 樣品重復(fù)性試驗結(jié)果

2.3.7 回收率試驗:稱取已知含量的樣品約0.15 g，平行9份，其中3份分別加入濃度為含0.25 mg/mL補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液各1 mL，3份分別加入含0.4 mg/mL補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液各1 mL，3份分別加入0.55 mg/mL的補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液各1 mL，照“供試品溶液制備”項下操作，測定，以下式計算方法的回收率，結(jié)果見表10。回收率%=測得總量-樣品含量/加入量×100%。

表10 回收率試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明:平均回收率為100.17%，RSD為1.6%，加樣回收率良好。

3 討論

補骨脂在癃閉舒片中作為君藥，其主要有效成分為補骨脂素和異補骨脂素，因補骨脂素和異補骨脂素是脂溶性成分，采用水提取補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素，收率偏低，影響藥效;筆者采取單獨乙醇提取補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素，補骨脂藥渣與其他藥材合并水提取，這樣每片癃閉舒片中含有補骨脂素和異補骨脂素含量總和比原工藝比較提高25%，藥效試驗正在進行中。

［1］國家藥典委員會.中國藥典 (一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.1 226-1 227

［2］周海嬰.RP-HPLC柱前衍生法測定復(fù)方甘草酸銨S分散片的含量 ［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(12):28-30